Прежде чем заняться взломом генетического кода, Георгий Гамов успел решить множество других научных проблем. Он родился в 1904 г. в черноморском портовом городе Одессе и впервые задумался об устройстве Вселенной, когда ему было всего шесть лет, увидев с крыши дома, где жила его семья, комету Галлея. Сорок лет спустя Гамов стал ведущим в мире сторонником теории, согласно которой Вселенная началась с Большого взрыва[6]. Одни коллеги Гамова по науке считали его гением – так, Нильс Бор называл его «еще одним Гейзенбергом»[7], сравнивая с основоположником квантовой механики и лауреатом Нобелевской премии. Другие же видели в нем чудака, «гигантского чертенка, который скачет от атомов и генов к космическим путешествиям»[8], как характеризовал его Джеймс Уотсон.

Гамов выделялся почти двухметровым ростом и специфическим чувством юмора, которое он демонстрировал даже в серьезных научных кругах. Когда он опубликовал теорию о космическом происхождении химических элементов, которую разработал вместе со своим студентом Ральфом Альфером, то неожиданно добавил соавтором своего коллегу Ханса Бете только для того, чтобы перечень «Альфер, Бете, Гамов» соответствовал греческому алфавиту.

В 1933 г. Гамов бежал из Советского Союза, а через год приехал в США. Двадцать лет он был профессором физики в Университете Джорджа Вашингтона, но в конце концов перебрался в мой родной Колорадский университет в Боулдере. В его честь там названо самое высокое здание – Башня Гамова, в которой расположен физический факультет. И хотя Гамов приобрел немалый опыт в области ядерной физики и космологии, в начале 1950-х гг. он пришел к выводу, что самый волнующий научный вопрос, остающийся без ответа, не имеет никакого отношения к происхождению Вселенной и поведению субатомных частиц. Более того, он вообще не имеет отношения к физике.

В июне 1953 г. Гамов прочитал в журнале Nature знаменитую статью Джима Уотсона и Фрэнсиса Крика, утверждавших, что структура ДНК представляет собой двойную спираль. Такая форма молекулы давала ключ к разгадке главной тайны: как наследственная информация удваивается, получая возможность передаваться из поколения в поколение? Каждая нить ДНК на всем своем протяжении состоит из четырех вариантов химических компонентов – нуклеотидов, которые содержат азотистые основания: аденин (А), тимин (Т), гаунин (Г) и цитозин (Ц)[9], формирующих комплементарные пары с основаниями другой нити двойной спирали ДНК. Напротив А всегда находится Т, а напротив Г – Ц.

Две нити двойной спирали ДНК соединены с помощью пар оснований. Участок в середине показан развернутым, чтобы были видны пары А-Т и Г-Ц

Двойная спираль напоминает скрученную застежку-молнию. Если ее расстегнуть, то на каждой стороне будет вся информация, необходимая для воссоздания противоположной стороны, потому что обе стороны точно комплементарны друг другу. Уотсон и Крик предположили, что именно так и происходит удвоение наследственной информации.

Жирным шрифтом показаны материнские нити ДНК, а курсивом – новосинтезированные дочерние

В письме от 8 июля 1953 г. Гамов поздравил Уотсона и Крика с тем, что биология стала частью «точных наук»[10]. Он с ходу предложил сотрудничество между научными областями для решения следующего важного вопроса, который занимал всех: как именно информация, записанная в этих цепочках из А, Т, Г и Ц, считывается, чтобы создавать в итоге руку, сердце, печень или мозг, а также гладкие и морщинистые горошины в саду монаха-августинца Грегора Менделя, первым предположившего, что подобные признаки передаются из поколения в поколение в виде неких отдельных единиц, которые сейчас мы называем генами? Гамов был убежден, что в его силах помочь Уотсону и Крику использовать физику и математику для расшифровки генетического кода.

Уотсон и Крик были польщены вниманием знаменитого физика, но, по воспоминаниям Уотсона, написанное от руки письмо Гамова «было настолько причудливым, что… [они] не поняли, насколько он серьезен»[11]. Но Гамов был очень серьезен. В следующие несколько месяцев он погрузился в расшифровку генетического кода. В то время он был консультантом Военно-морских сил США, поэтому обратился за помощью не только к химикам и физикам, но и к военным криптографам. Оказалось, однако, что для разгадки тайны ДНК нужна была ее дочерняя молекула – рибонуклеиновая кислота, или РНК.

В биологии словосочетание «расшифровать генетический код» означает «понять, как ДНК кодирует белки». Жизнь построена из белков, они главные «воротилы» во всех живых организмах нашей биосферы. У человека некоторые белки выполняют структурную функцию: из них состоят мышечные волокна, кожа и волосы. Некоторые белки работают как ферменты, расщепляя пищу, которую мы едим, на отдельные компоненты и потом используя их для постройки новых клеточных систем. Некоторые образуют отверстия в оболочке клетки, и через эти отверстия одни ионы или питательные вещества могут проникать внутрь клетки, а другие – выбрасываться наружу. Некоторые работают как сигнальные молекулы: они получают информацию из внешнего мира и активируют соответствующие внутренние процессы. Еще есть белки-антитела, защищающие нас от чужеродных захватчиков, таких как вирусы. Короче, белки поражают своим разнообразием.

С точки зрения химии белки – линейные полимеры, состоящие из сотен и даже тысяч аминокислот. Таких аминокислотных составляющих существует 20 видов, у каждого из них свое название, например: лизин, валин, фенилаланин. Для каждого белка характерна своя последовательность аминокислот, соединенных в цепочку[12]. От этой последовательности зависит, какую по форме трехмерную структуру примет белок, чтобы выполнять свою конкретную функцию, например участвовать в переваривании пищи в желудке или в передаче сигнала между нервными клетками в мозге. Таким образом, когда мы слышим, что надо есть рыбу, сыр тофу или бургеры из сои, чтобы «обеспечить достаточно белка в рационе», речь идет не об одном белке, а как минимум о тысяче различных белков. И каждый закодирован своим собственным геномом в молекуле ДНК.

Хотя белки построены из аминокислот 20 видов, в состав ДНК входит всего четыре основания. Итак, с одной стороны во фрагменте ДНК у нас закодирован ген, который состоит из последовательности различных комбинаций А, Г, Т и Ц, а с другой – последовательность из аминокислот 20 видов, образующих соответствующий белок. Гамов пытался выяснить, как именно расположение оснований ДНК определяет, или кодирует, каждую из этих 20 аминокислот. В 1954 г. он пригласил Уотсона, Крика и других известных ученых разного профиля (всего 20 человек – по одному на каждую аминокислоту), чтобы направить совместные умственные усилия на решение проблемы кодирования белков.

Для каждого члена этого маленького интеллектуального братства взломщиков кода Гамов приготовил шерстяной галстук с вышитой на нем нитью РНК. Он окрестил эту группу Клубом РНК-галстуков. «А почему не Клубом ДНК-галстуков?» – спросите вы. Дело в том, что Джим Уотсон убедил Гамова направить усилия по расшифровке кода именно на РНК, руководствуясь принципами строения клетки[13]. Хотя у высших организмов ДНК находится внутри ядра, белки образуются снаружи ядра, в области, называющейся цитоплазмой[14]. При таком пространственном разобщении требуется некий посредник, который должен переносить информацию от ДНК к месту синтеза белков. Некоторые прогрессивные ученые полагали, что таким посредником может служить РНК, которая во множестве содержится и в ядре, и в цитоплазме.

Уже в начале 1900-х гг. химики анализировали состав РНК и ДНК и поняли, что эти молекулы состоят из одного биохимического теста. Их полные названия – рибонуклеиновая кислота и дезоксирибонуклеиновая кислота – показывают, насколько они близки между собой. «Дезокси» означает, что в каждом структурном компоненте ДНК на один атом кислорода меньше, чем в РНК. Этот лишний атом кислорода делает РНК химически гораздо менее стабильной молекулой.

На протяжении многих десятилетий считалось, что ДНК и РНК – химические компоненты, не выполняющие никаких функций[15]. Ученые уделяли им мало внимания. Гораздо интереснее были белки, играющие роль ферментов или сигнальных веществ, как, например, инсулин. ДНК вышла на первый план в биологии только после того, как Освальд Эвери с коллегами из Рокфеллеровского университета показал, что это молекула, отвечающая за наследственные изменения у бактерий[16], а Уотсон и Крик в 1953-м описали структуру ДНК в виде двойной спирали[17]. Поскольку еще в 1947 г. исследователи выдвигали теорию, что РНК копирует ДНК[18], возникло предположение, что РНК должна также играть важную роль в химических процессах у живых организмов.

Обычно РНК состоит только из одной цепочки, а ДНК – двойная спираль, тем не менее обе молекулы говорят на одном языке. Как и ДНК, последовательность РНК записана с использованием алфавита из четырех букв. Первые три – А, Г и Ц – такие же, как и в ДНК. Четвертая буква – У (урацил) – занимает в алфавите РНК такое же место, что и Т в алфавите ДНК. Таким образом, когда РНК копирует участок ДНК, она несет ту же информацию.

Гамов всегда любил масштабные обобщающие теории, поэтому начал работать над решением проблемы кодирования, не имея ничего, кроме карандаша, бумаги и собственного мозга. В 1953 г., тогда же, когда открыли двойную спираль, он предположил, что три основания могут кодировать одну аминокислоту[19]. Он опирался на математические расчеты. Если взять четыре вида букв алфавита ДНК или РНК и попробовать составить все возможные двухбуквенные комбинации, то у вас получится только 16 вариантов. Это слишком мало, чтобы записать все 20 видов аминокислот, которые образуют белок. Однако если попробовать из четырех букв алфавита ДНК или РНК собрать все возможные трехбуквенные комбинации, то получится 64 таких триплетных кодона. Этого более чем достаточно, чтобы закодировать 20 аминокислот. С такой задачей могут справиться и более длинные последовательности оснований, но вполне хватит трехбуквенных. Таков наиболее экономный формат генетического кода.

Однако какие именно три основания кодируют каждую аминокислоту? Хотя Гамов и привлек крупнейшие умы XX столетия к этой проблеме, члены галстучного клуба лишь глубоко в ней завязли. К концу 1950-х гг. Гамов оставил попытки взломать код, убедившись, что решение задачи не может быть найдено на «чисто теоретической основе»[20].

Гамову нужен был биологический аналог Розеттского камня. Только вместо текста, написанного одновременно египетскими иероглифами и греческим языком, там должна была изображаться последовательность аминокислот и кодирующая ее последовательность РНК. Но такого камня не существовало – ученым необходимо было его создать. И для этого надо было определить, существует ли на самом деле гипотетический посредник, может ли РНК быть недостающим звеном между нашими генами и структурными элементами живого – белками.

В 1950-х гг. множество ученых, в том числе Джим Уотсон и Фрэнсис Крик, искренне верили в теорию, утверждавшую, что РНК может переносить информацию из ядра клетки, от ДНК, к цитоплазме, где синтезируются белки. Но когда исследователи попытались найти эмпирические доказательства того, что РНК выступает посредником в живых системах, вначале их ожидали неудачи. Первое разочарование наступило, когда выяснилось, что в большей части молекул РНК в цитоплазме клетки основания А, Г, Ц и У встречаются в одинаковых пропорциях, независимо от того, какие белки синтезирует клетка. В этом было не больше смысла, чем если бы обнаружилось, что в Девятой симфонии Бетховена и в "Bad Romance" Леди Гаги разные ноты встречаются в одних и тех же пропорциях. Можно ожидать, что у этих совершенно разных музыкальных произведений будет соответственно разное соотношение фа-диезов, си-бемолей и других нот. Аналогично предполагалось, что у матричных РНК (мРНК), кодирующих разные белки, состоящие из разных последовательностей аминокислот, должно быть разное соотношение А, Г, Ц и У.

Второе разочарование было связано с тем, что большинство молекул РНК в цитоплазме очень стабильны: появившись, они довольно долго сохраняются. Однако исследователи наблюдали случаи, когда клетка быстро, всего за несколько минут, переключалась с одного набора белков на совершенно другой. Например, если поменять источник пищи для бактерий, они остановят производство пищеварительных ферментов для прежней еды и немедленно начнут генерировать белки, подходящие для новой. Точно так же если бактерию заразит вирус (а есть вирусы, поражающие именно бактерии, они называются бактериофагами или просто фагами), то бактерия переключится с производства бактериальных белков на белки фага. Следовательно, настоящая мРНК должна быть нестабильной, чтобы можно было быстро начать выработку другого белка. Крайне стабильная природа большинства клеточных РНК, казалось, не позволяла им быть тем посредником, который искали исследователи.

Среди ученых, все еще убежденных в том, что мРНК существует, но ускользает от наблюдения, были сотрудники Института Пастера в Париже Франсуа Жакоб и Жак Моно. Ранее они уже сделали важнейшие открытия, обосновав, как именно у бактерий включаются и выключаются гены, и теперь обратили свое внимание на РНК. В 1960 г. во время визита в Кембридж Жакоб встретился со своими друзьями Фрэнсисом Криком и Сиднеем Бреннером, возглавлявшим лабораторию в Королевском колледже[21]. Жакоб рассказал о своих последних экспериментах с регуляцией генов у бактерий, а затем разговор перешел к захватывающим догадкам о роли мРНК как связующего звена между геном и белком.

Внезапно и почти одновременно Крик и Бреннер подскочили. Они вспомнили недавние эксперименты Кена Волкина и Ларри Астрахана – исследователей из Окриджской национальной лаборатории в штате Теннесси. Изучая бактерию кишечную палочку (Escherichia coli), зараженную фагом Т2, Волкин и Астрахан обнаружили быстрое образование новых молекул РНК, которые были меньше, чем содержащиеся в клетке стабильные РНК[22] (сейчас мы знаем, что стабильные РНК – это составная часть рибосом, фабрик по производству белков). По целому ряду причин Волкин и Астрахан интерпретировали свои данные так, что РНК превращается в ДНК. Но что, если в действительности они заметили ту самую неуловимую мРНК?

Такая возможность воодушевляла, но гипотезу мРНК нужно было подтвердить экспериментально. Сидней Бреннер и Франсуа Жакоб планировали через несколько недель навестить генетика Мэтью Мезельсона в Калифорнийском технологическом институте. Было решено, что они втроем проведут необходимые тесты. Мезельсон вместе со своим коллегой Фрэнком Сталем незадолго до того применил новую методику с использованием чрезвычайно быстро вращающейся центрифуги – они проверяли предположение Уотсона и Крика, что во время репликации ДНК нити двойной спирали расходятся. Их результаты подтвердили гипотезу, согласно которой каждая дочерняя двойная спираль состоит из одной «старой» родительской нити и одной новосинтезированной.

Теперь Бреннер, Жакоб и Мезельсон хотели использовать такую же ультрацентрифугу в попытке найти иголку мРНК в стоге рибосомных РНК. Они намеревались заразить кишечную палочку фагом, который заставит бактерию начать вырабатывать другие белки. Одновременно с фагом ученые добавили бы радиоактивный урацил (помеченный углеродом–14), который встроился бы только в новообразованные молекулы мРНК фага, но не в существующие бактериальные РНК. Если гипотеза верна, то мРНК фага должна была появиться как раз в этот момент. Такой результат позволил бы найти пропущенное звено между ДНК и белком.

И действительно, Бреннер, Жакоб и Мезельсон с помощью ультрацентрифуги обнаружили радиоактивную мРНК фага, которая была явно меньше, чем РНК в рибосомах. Как и предсказывалось, эти молекулы РНК были короткоживущими, они соединялись с существующими бактериальными рибосомами для синтеза белков новых видов, необходимых вирусу для его черного дела[23]. Какой бы неуловимой ни была мРНК, ее наконец удалось поймать.

Чтобы понять этот биологический процесс, представьте себе проигрыватель пластинок. Рибосома – сам проигрыватель, мРНК – виниловая пластинка, а белок – музыка, которую вы слышите, когда опускаете иглу. В зависимости от вашего настроения вы можете менять пластинки, но оборудование остается неизменным. Точно так же как проигрыватель заставляет звучать любую пластинку, рибосома может работать с любой попавшейся мРНК. Именно от мРНК зависит, какой конкретный белок производится, будь то белки фага, кишечной палочки или какие-либо другие; пластинка определяет, какую музыку вы слышите.

Ученым было так сложно найти мРНК, потому что только 5% от всего множества РНК, содержащихся в клетке бактерии, – те, что представляют матричную РНК. Остальные 95% – это рибосомные РНК. Более того, у кишечной палочки около 4000 генов, каждый из которых дает мРНК разного размера и с разной последовательностью оснований. То есть мРНК конкретной разновидности в клетке гораздо меньше 5%. И, наконец, большинство молекул мРНК живут всего несколько минут, поэтому их очень трудно ухватить. Рибосомные РНК, напротив, не только широко распространены в цитоплазме, но и живут довольно длительное время, так что легко понять, почему ученым, стоявшим у истоков данного направления науки, потребовалось столь много времени, чтобы разобраться во всей этой истории с разными РНК.

Сравнение с проигрывателем помогает объяснить, как рибосомы и мРНК работают совместно, чтобы в итоге образовать белок. Но когда требуется понять, как РНК кодирует белок, нам стоит выключить музыку и открыть книгу.

Страницы большинства книг заполнены письменной речью – буквами, словами, предложениями. В алфавите книги жизни, записанной на языке ДНК, не 26 букв, как в английском языке, и не 22 буквы, как в иврите, а всего 4 буквы: А, Г, Ц и Т. Значение каждого слова и каждого предложения определяется последовательностью этих четырех букв – тем, в каком порядке они расположены.

Итак, сколько потребуется книг, чтобы передать суть жизни, то есть описать всю ДНК в определенном организме? Конечно, ответ зависит от размера генома – общего количества ДНК в клетке организма. Геном человека насчитывает около 3 млрд букв, или оснований, упакованных в 23 хромосомы[24].

Предположим, что страница, написанная обычным шрифтом, содержит примерно 3000 знаков; значит, для записи генома человека потребуется миллион страниц. Большая книга может содержать до 500 страниц, тогда для последовательности всего генома необходимо 2000 книг – это многовато для домашней библиотеки, но лишь малая часть хранилища городской библиотеки. Каждая хромосома состоит из одной молекулы ДНК и соответствует примерно 90 книгам. Геном бактерий, например кишечной палочки, намного меньше. У бактерий весь геном расположен на одной кольцевой хромосоме. Он содержит 4,5 млн оснований и вполне мог бы разместиться в трех библиотечных книгах.

Как мы уже выяснили, для создания белка нам нужен посредник в виде РНК, чтобы перенести информацию от ДНК к рибосоме. РНК, которые образуются естественным путем, не копируют постранично огромную книгу ДНК. У них есть определенные точки начала и окончания, которые, скорее всего, не совпадают с разрывами страниц. В общем, мы можем представить мРНК не как фотокопию целой страницы бумажной книги, а как выделенный участок текста из электронной книги, скопированный в несколько кликов в отдельный электронный документ. Мы просто выделяем движением курсора определенный фрагмент текста и затем вставляем его в пустой документ в нашем текстовом редакторе. А с помощью простой функции «найти/заменить» мы можем одновременно заменить все Т в ДНК на У в РНК, смоделировав таким образом естественный химический процесс.

Эта процедура копирования и вставки, когда фрагмент ДНК копируется в виде молекулы РНК, постоянно происходит в нашем теле, ведь она запускается всякий раз при необходимости синтезировать новые белки. мРНК копирует разные области ДНК в зависимости от того, что требуется в конкретное время и в конкретном месте. У детей копируются иные участки генома, чем у взрослых. В сердце копируются одни участки генома, а в мозге, печени и коже – другие. То есть процесс копирования строго регулируется.

После того как процедура копирования и вставки завершена, мы можем рассмотреть последовательность нашей мРНК. Это набор из А, Г, Ц и У, например такой:

Допустим, что мы знаем, как расшифровываются группы из трех оснований – триплетные кодоны. Вот наш словарь. Вместо аминокислот для каждого кодона я выбрал трехбуквенные слова:

Мой словарь чрезвычайно ограничен, в нем всего 20 слов по аналогии с 20 аминокислотами. Некоторые из этих слов закодированы единственным кодоном («жук» закодирован ЦУЦ). Другие слова (кот, ест, уху и т. д.) закодированы более чем одним кодоном, точно так же как и в генетическом коде. Вы можете спросить, почему в природе сформировалась система, где используется так много кодонов (64), чтобы зашифровать всего 20 слов (аминокислот). Неужели код нельзя организовать более изящным способом?

Эта кажущаяся неказистость – одна из тех вещей, которые всегда ставят физиков вроде Гамова в тупик. Если вы знаете уравнения Максвелла, вы можете решить проблему классической физики. Но в биологии действует только одно правило: «Главное, чтобы работало». Как только система, какой бы заумной она ни казалась, начинает хорошо функционировать, она закрепляется в процессе эволюции и ее практически невозможно изменить. И неважно, что хороший инженер мог бы сделать это устройство проще и эффективнее.

Теперь, когда мы знаем, как перевести сообщение из последовательности кодонов в содержательный текст, нам надо понять, где начинать чтение и где его заканчивать. Следует ли начать с левого конца, прочтя ГУА как «шли», и продолжить чтение до правого конца строки? Это может показаться разумным, но у природы есть другой способ. Триплет АУГ используется для обозначения начала предложения. Соответствующее правило для нашего словаря означает, что предложение должно начинаться со слова «ура», которое закодировано как АУГ. То есть мы просто просматриваем последовательность слева направо в поисках первого АУГ, а затем оттуда начинаем читать с помощью словаря.

Все идет хорошо, пока мы не наткнулись на кодон УАГ, которого нет в нашем словаре. Ах да, нам нужен еще один триплет, чтобы обозначать конец предложения – точку[25]. Так и сделаем.

Теперь наша расшифровка завершена:

Когда мы определили старт– и стоп-кодоны (АУГ и УАГ), разделять кодоны пробелами уже нет необходимости. Если у нас есть последовательность мРНК в виде непрерывной строки букв и мы знаем, что надо читать по три буквы за раз, то мы все равно получим нужную информацию.

Хотя Гамов предложил триплетную природу кода, на протяжении 1950-х гг. это оставалось лишь хорошей догадкой. А в 1961 г. Фрэнсис Крик со своими коллегами провел остроумный эксперимент с мутациями в гене фага, вызванными акридиновыми красителями, и окончательно доказал наличие триплетов[26]. Акридиновые красители – плоские молекулы, похожие на основания ДНК. Они встраиваются в двойную спираль, и при удвоении молекулы ДНК их ошибочно принимают за основания, что приводит к вставке неправильных оснований в дочернюю цепь. Представьте себе книги, расположенные в ряд на книжной полке. Если вы втиснете туда еще одну книгу, то все другие должны сдвинуться на одну позицию, чтобы вставленная книга поместилась. А если вы добавите две книги, то остальные сдвинутся на толщину этих томов.

С помощью нашей лингвистической аналогии можно продемонстрировать, как такие вставки могут повлиять на сообщение и как множественные вставки подтверждают идею триплетного кода. Начнем с нашего гипотетического сообщения. Я выделил старт– и стоп-кодоны курсивом:

А вот что происходит, если из-за акридинового красителя в случайное место будет вставлена У (выделено подчеркиванием):

Наше предложение начинается правильно, но вставка У сдвигает рамку считывания. Мы называем это «мутацией со сдвигом рамки». В геноме человека такие мутации происходят довольно часто и могут приводить к неприятным результатам, например к муковисцидозу, болезни Крона и болезни Тея – Сакса. Сдвиг рамки так опасен потому, что после вставки получается бессмысленный набор слов. Более того, кодон УАГ, который раньше обозначал конец предложения, теперь не прочитывается, поэтому бессмысленное предложение все продолжается и продолжается. Если бы эта мРНК кодировала белок, то он был бы бесполезным.

Давайте теперь посмотрим, что произойдет, если мы добавим две молекулы акридинового красителя, приведя к вставке двух оснований. Это так же разрушительно, как и вставка одного основания:

В данном случае сдвиг рамки считывания привел к появлению стоп-кодона УАГ в правом конце строки, но полученное предложение все равно бессмысленно. Если бы это была мРНК, то измененный белок опять же оказался бы бесполезен.

И, наконец, давайте обратимся к последствиям вставки трех оснований:

Если код триплетен, как показано, то в предложении появляется лишнее слово «или», но остальные слова на месте. В целом предложение более или менее можно понять.

Именно это показал Крик с коллегами, подтвердив, таким образом, исходную гипотезу Гамова. Вставка одного основания была фатальна. Двух – тоже фатальна. Но вставка трех более или менее сохраняла функциональность! То есть кодоны должны были быть образованы группами из трех оснований.

Гамов и его Клуб РНК-галстуков предположили, что генетический код трехбуквенный, а РНК, вероятно, выступает связующим звеном между ДНК и белками. Бреннер, Жакоб и их коллеги подтвердили второе предположение – убедительно идентифицировали мРНК, которая переносит информацию из нашей ДНК в клеточные фабрики по производству белков – рибосомы. Но мы все еще не могли прочитать эту информацию. К началу 1960-х гг. генетический код так и не был расшифрован – пока за дело не взялся молодой ученый Маршалл Ниренберг.

В 1959 г. Ниренберг получил должность независимого исследователя в Национальном институте артрита и метаболических заболеваний[27] в Бетезде (штат Мэриленд). Прежде чем заняться биохимией и защитить в этой области диссертацию, Ниренберг выполнил магистерскую работу во Флоридском университете на ручейниках – насекомых, чьи личинки живут в воде, а взрослые особи напоминают мотыльков. Возможно, Ниренберг не хотел признавать, что начал свою научную карьеру, работая с букашками, так как впоследствии он опустил этот факт в своей нобелевской лекции. Ниренберг смело предпринял попытку взломать генетический код. Он мало общался с ведущими авторитетами в этой области и никогда не получал шерстяной РНК-галстук. В отличие от Гамова, полагавшегося только на перо и бумагу, Ниренберг решил подступиться к проблеме кода как экспериментатор, с помощью биохимии. Для этого требовалось воссоздать в пробирке процесс синтеза белка, когда белок получается на основе мРНК.

Ниренберг опирался на революционное достижение коллег-биохимиков из Массачусетской больницы общего профиля (MGH) в Бостоне – Элизабет Келлер и Пола Замечника, которые разработали метод синтеза белков вне клетки с помощью компонентов, выделенных из печени крысы[28]. Замечник и другие авторы впоследствии показали, как то же самое можно делать и с экстрактом клеток кишечной палочки. Эту разработку и применил Ниренберг. Если описывать кратко, его подход заключался в том, что клетки бактерии разрушались, чтобы получить неочищенные рибосомы, а затем к ним добавляли разные последовательности РНК в качестве матрицы для синтеза белка[29]. Пройдя несколько раз по ложному следу, Ниренберг и его сотрудник Генрих Маттеи наконец столкнулись с тем, что простая молекула РНК, состоящая только из У, так называемая поли(У), определяет синтез белка, в состав которого входит лишь аминокислота фенилаланин. Прелесть молекулы поли(У) была в том, что, откуда бы рибосома ни начинала считывать информацию, получался один-единственный вариант триплета – УУУ, который неизменно кодировал фенилаланин. Так впервые был разгадан один из элементов генетического кода: УУУ кодирует фенилаланин[30].

После этого стал понятен дальнейший путь: скармливать рибосомам различные последовательности РНК и смотреть, какие белки получаются. Выяснилось, что поли(Ц) и поли(А) кодируют соответственно полипролин и полилизин. Таблица расшифрованных значений кодонов росла: три были найдены, оставалось определить еще 61. Безусловно, первые три кодона были простыми, потому что все буквы в каждом кодоне были одинаковыми. Для более сложных вариантов кодонов требовался другой подход.

И тут на сцене появился Гобинд Корана[31]. Он родился в бедной индуистской семье в Райпуре, который сейчас часть Пакистана, а тогда относился к Индии. Корана учился в Англии и Швейцарии. Впервые он получил известность благодаря работам в области изучения генетического кода, когда был профессором в Висконсинском университете в Мадисоне. Корана со своей группой изобрел метод химического синтеза ДНК, при котором нуклеотиды присоединялись к процессу по одному. Затем он использовал недавно открытый фермент, который синтезировал копию РНК с ДНК[32]. Красота этого метода заключалась в том, что он позволял очень точно задать последовательность ДНК и, соответственно, скопированной с нее молекулы РНК. Эти РНК помещали в систему синтеза белка в искусственных условиях, где они работали как матрицы для синтеза соответствующей последовательности аминокислот[33]. Корана получал все возможные комбинации трех оснований, скармливал их системе синтеза белка в искусственных условиях и анализировал, какие цепочки аминокислот образуются в результате. Таким образом, он помог заполнить таблицу генетического кода, за что в 1968 г. разделил Нобелевскую премию по физиологии и медицине с Маршаллом Ниренбергом[34].

Когда Гамов прочитал об этих открытиях в новостях, он обрадовался, что проблема кода наконец решена, хотя и не мог удержаться от выпада в адрес экспериментального подхода. «Это решение выглядит значительно менее элегантным, чем простая теоретическая корреляция, которую я изначально мысленно представлял, – сказал он. – Но у него есть неоспоримое преимущество – оно верное»[35].

Расшифровка кода, используемого мРНК для записи структуры белков, была огромным достижением, но без ответа оставался еще один большой вопрос. Наличие кода важно, но что потом? Должен совершаться процесс, который «прочитывает» всё, что закодировано. Как же мРНК обеспечивает расстановку аминокислот в нужной последовательности, чтобы они соединились и получился белок?

Фрэнсис Крик в 1955 г. пришел к ответу на этот вопрос путем умозаключений, и его предположение стало беспрецедентным триумфом теоретического подхода в биологии. Он вообразил не описанный ранее класс молекул, руководствуясь исключительно убеждением, что они должны представлять собой недостающее звено в большой системе генетического кода[36]. Так Крик предсказал существование группы «адаптерных молекул», у которых по два конца. Одним концом каждая молекула соединена с какой-либо из 20 аминокислот. Другой конец должен распознавать соответствующий триплетный кодон на мРНК и связываться с ним[37].

Эти адаптеры, соединяющие аминокислоты и мРНК, можно сравнить с переходниками, с помощью которых разные электронные устройства подключаются к розеткам. Чтобы зарядить наушники, вам нужен правильный переходник для нужной вилки, форма которой зависит от того, находитесь вы в США, Великобритании или Германии. С аминокислотами то же самое, что и с наушниками. У вас есть розетка (триплетный кодон) и подходящая к ней трехштырьковая вилка – антикодон. Поскольку кодон и антикодон комплементарны друг другу, они соединяются за счет связей между парами оснований. И, подобно удлинителю, вмещающему несколько розеток, молекулы-адаптеры выстраиваются в ряд, соединяя кодоны мРНК с соответствующими аминокислотами, так что получаются растущие цепочки, которые в итоге обеспечивают образование белков. По крайней мере, такова была гипотеза Крика.

Фрэнсис Крик предположил, что каждый триплетный кодон на мРНК (снизу) должен быть распознан некой «адаптерной молекулой», несущей соответствующую аминокислоту, например лизин или валин, показанные на рисунке. Это можно сравнить с зарядными кабелями для телефонов и наушников, которые выступают в качестве переходников, соединяя трехштырьковую розетку и электронное устройство

Однако чистая теория может завести нас слишком далеко. Кто-то должен был отправиться в лабораторию и проверить, можно ли найти такие молекулы-адаптеры. Этим кем-то стал Пол Замечник, разработавший метод синтеза белка, благодаря которому Ниренберг и открыл первый кодон. Замечник предварительно пометил аминокислоты радиоактивным изотопом углерода, чтобы можно было их отследить, – примерно так действуют банки, когда прячут в мешки с деньгами взрывающуюся капсулу с краской, чтобы выявить купюры, если их украдут. Когда Замечник добавил эти радиоактивные аминокислоты в свою систему синтеза белка в искусственных условиях, случилось нечто удивительное. РНК малого размера стали радиоактивны. Это означало, что аминокислоты присоединились к РНК. Никто прежде такого не наблюдал, но это именно то, что должно было бы произойти, если бы существовали РНК, выполняющие функцию адаптеров между кодонами и аминокислотами[38]. Позднее эти малые молекулы получили название транспортные РНК (тРНК), потому что они переправляют нужную аминокислоту к белковой цепи, растущей внутри рибосомы. И, как мы увидим еще неоднократно, тРНК хоть и мелкие, но могущественные молекулы.

К середине 1960-х гг. некоторым ученым казалось, что история РНК закончена. Каждая мРНК управляет синтезом «своего» белка с помощью генетического кода, который на тот момент был уже взломан. Кроме того, в синтезе белка участвовали стабильные РНК двух видов: транспортные РНК, которые соединяли каждый кодон мРНК с соответствующей аминокислотой, и рибосомные РНК, которые, о чем мы еще поговорим подробнее, строили белок.

Даже сегодня многие люди рассматривают РНК примерно так же. Они видят в ней служанку при ДНК, обеспечивающую бесперебойную работу клеточных механизмов, которые превращают наследственную информацию в живую материю. Безусловно, этот биологический процесс необходим для выживания каждого организма на Земле. И если бы на сказанном история РНК действительно заканчивалась, это все равно было бы колоссальным достижением нашей маленькой молекулы. Однако, как оказалось, передача сообщений всего лишь одна из суперспособностей РНК.

Трудно представить более идиллическое место для научного симпозиума, чем лаборатория Колд-Спринг-Харбор. Она расположена на острове Лонг-Айленд и больше похожа на летний лагерь, чем на исследовательский центр: среди холмов, которые весной украшаются цветущими магнолиями, азалиями и кизилом, стоят дощатые домики, а на ветру покачиваются парусные лодки. Лаборатория была основана в 1890 г. и всегда имела репутацию серьезного, хоть и несколько сонного научного учреждения. Именно здесь начиная с 1940-х гг. генетик Барбара Мак-Клинток в уединении проводила свои кропотливые эксперименты, отслеживая вариации окраски кукурузных зерен, чтобы определить, как функционируют в клетках гены и хромосомы. Ее открытие «прыгающих генов» в итоге было удостоено Нобелевской премии.

Сонливость быстро слетела с лаборатории Колд-Спринг-Харбор, когда в 1968 г. ее директором стал Джим Уотсон. Он был столь проницательным, амбициозным и напористым, что быстро превратил лабораторию в мощный центр, который выдавал одно крупное научное открытие за другим. В тот период лаборатория стала знаменита проводившимися там конференциями, на которых молекулярные биологи делились своими недавними находками. Она была и остается местом, где можно сразу узнать о новейших достижениях, без многомесячного ожидания публикации, и наладить новое сотрудничество.

В июне 1977 г. темой симпозиума в Колд-Спринг-Харбор стала структура и функции хромосом у высших организмов. В то время я был научным сотрудником в Массачусетском технологическом институте, работал именно в данной области и очень обрадовался возможности посетить симпозиум. До сих пор помню сильнейшее восхищение, когда две группы исследователей, одной из которых руководил мой сосед по МТИ Фил Шарп, а другой – Рич Робертс из Колд-Спринг-Харбор, вышли выступать и рассказали о решении загадки, над которой ученые бились более десяти лет.

Что же это была за великая тайна? После того как на примере кишечной палочки и ее фагов была выявлена связь между ДНК, мРНК и белком, многие ученые переключились на исследование более сложных организмов, таких как растения, животные и особенно человек. Имелись все основания ожидать, что фундаментальные принципы хранения и передачи биологической информации будут неизменны у всех форм жизни. Как однажды сказал нобелевский лауреат Жак Моно, «то, что верно для кишечной палочки, должно быть верно и для слона»[39]. Но когда биохимики изучили человеческие клетки, выращенные в чашках Петри в термостате, они пришли в замешательство. Предполагалось, что мРНК сначала обнаружится в клеточном ядре, где находился ее хромосомный прародитель – ДНК. И в самом деле, РНК нашлась в ядре, но она казалась слишком большой, чтобы быть готовой мРНК, – в среднем в 10 раз больше[40], чем требуется для кодирования белка. Это казалось странным, ведь мРНК, которая поступала из ядра в цитоплазму, была как раз нужного размера, чтобы кодировать белок.

Действительно ли эта огромная РНК, найденная в ядре клетки, должна была превратиться в мРНК? Если да, то что делали все эти лишние нуклеотиды в ядерной РНК, коль скоро они не кодировали белок? В тот день в Колд-Спринг-Харбор ответ был обнародован, и он стал первым сигналом к пониманию того, что РНК способна на большее, чем просто передавать информацию от ДНК.

Я работал через дорогу от лаборатории Фила Шарпа в МТИ, но это еще не означало, что я мог непосредственно наблюдать открытие Фила. Иногда я пересекал Эймс-стрит и заходил в его лабораторию в Онкологическом центре, чтобы посоветоваться насчет проблем с экспериментами. Там работала моя приятельница Клэр Мур, и они с Филом всегда охотно обсуждали мои исследования, но дружно отмалчивались по поводу своих собственных.

Это было довольно странно. Ученые, как правило, не могут удержаться, чтобы не рассказать о своей работе, о потрясающем открытии, которое может случиться в ближайшем будущем. Однако Фил, Клэр и постдокторант Сью Берже знали, что нашли что-то особенное, и не хотели поднимать шум. И только год спустя, сидя в аудитории Колд-Спринг-Харбор, я узнал, как Фил и Рич Робертс решили загадку[41] про неподходящий размер человеческой мРНК.

Ключ к разгадке был получен благодаря аденовирусу – ДНК-вирусу, вызывающему у людей обычную простуду. Подобно тому как бактериофаги помогли первым молекулярным биологам понять принципы работы генов у бактерий, человеческие вирусы подсказали подход к изучению молекулярных особенностей биологии человека. В конце концов, и фаги, и человеческие вирусы обманом заставляют клетки своих хозяев обеспечить инфекционный цикл вируса за счет ресурсов клетки, поэтому паразиты должны использовать те же фундаментальные биологические механизмы, что используют их хозяева. Изучение вирусов имеет и практические преимущества: зараженные клетки содержат множество копий вирусной ДНК и соответствующую полученную РНК; таким образом, исследователи получают много материала для работы.

Обе группы, из МТИ и Колд-Спринг-Харбор, сначала составили карты расположения разных генов в хромосоме аденовируса. Они не ожидали, что это приведет к какому-то крупному открытию, картирование требовалось, просто чтобы получить необходимую информацию для дальнейшей работы – предстояло выяснять, как экспрессируются вирусные гены. Сравнивая вирусную ДНК с ее мРНК-копией из цитоплазмы клетки, исследователи ожидали, что ДНК и мРНК будут соответствовать друг другу в пределах всей последовательности. Разумеется, у бактерий было бы именно так.

Однако обнаружилось, что длинные внутренние участки мРНК, которые должны были бы присутствовать, если бы мРНК была непосредственной копией ДНК, просто исчезли. Оказалось, что мРНК собиралась из кусочков, некоторые фрагменты из середины были вырезаны, а концевые участки последовательности соединены друг с другом. Исследователям пришлось признать, что кодирующие области генов аденовируса не были непрерывными, а состояли из фрагментов, разделенных участками некодирующей ДНК, которые мы теперь называем интронами.

Слушатели этого доклада в Колд-Спринг-Харбор были ошеломлены. Сам Джим Уотсон, присутствовавший в тот день в аудитории, называл это открытие «бомбой». Считалось, что матричная РНК – непрерывная копия своего гена. Это казалось единственным эффективным вариантом, и сложно было понять, почему белок-кодирующие участки ДНК могут быть разделены интронами и как эти интроны могут вырезаться. Являлись ли все эти сложные операции, в ходе которых фрагменты генетической информации попадали в ДНК, но исключались из мРНК, просто бессмысленной акробатикой, неким эволюционным танцем, никуда не приводящим? Или в процессе такого вырезания и соединения выполнялись какие-то важные задачи? Какое-то время мир молекулярной биологии сосредоточился на этом вопросе, изо всех сил пытаясь найти ответ.

Большинство белок-кодирующих генов у человека и многих других эукариотов прерываются участками некодирующей ДНК, называемыми интронами. Каждый интрон (на схеме он светло-серый) транскрибируется как часть РНК-предшественника (в середине), который потом подвергается сплайсингу до функциональной мРНК (внизу)

Вскоре выяснилось, что все обстоит еще сложнее. Ученые начали понимать, что интроны встречаются не только у вирусов, а характерны и для эукариотов – организмов, хранящих свою ДНК в ядре. Как только было объявлено о существовании интронов у аденовирусов, многие ученые в лабораториях по всему миру поняли, что в генах, которые они изучают, тоже вставлены интроны. Например, уже в 1977 г. биологи из Гарварда Ширли Тилгман[42] и Фил Ледер обнаружили, что кодирующая последовательность человеческого гена белка крови гемоглобина разделена двумя интронами. И интроны, и кодирующие участки копировались с гена, так что в ядре клетки образовывалась длинная молекула РНК, но затем, прежде чем мРНК попадала в рибосомы для образования белка, мать-природа доставала секатор[43] и волшебным образом вырезала вставки.

Для описания этого процесса Фил Шарп использовал слово сплайсинг – так в морском деле называется прием, используемый при ремонте канатов. Моряк может обрезать канат выше и ниже обветшавшего участка, выбросить поврежденный кусок и соединить вместе концы двух крепких частей веревки, переплетя их.

Можно представить себе интрон как несколько бессмысленных слов, последовательность «бла-бла-бла», прерывающих осмысленное высказывание, вроде «Вы сегодня очень приятно бла-бла-бла-бла-бла пахнете». С помощью текстового редактора нетрудно это быстро исправить. Достаточно выделить неуместную вставку, нажать кнопку «удалить» – и все «бла» будут вырезаны, а останется лишь «Вы сегодня очень приятно пахнете». Природа использует аналогичный способ для удаления интронов из мРНК, чтобы получить чистую последовательность, которая требуется при производстве белка.

Теперь ученые поняли, почему РНК, созданная в ядре и содержащая все эти интроны, изначально была значительно длиннее, чем мРНК, из которой интроны были вырезаны. Но, как обычно случается в науке, один решенный вопрос потянул за собой другие. Какова функция у этих интронов? Действительно ли они бесполезны, как считали некоторые ученые? Или с их помощью мы сможем понять не только чем отличается слон от кишечной палочки, но и что делает нас людьми?

Геномом называют совокупность ДНК во всех хромосомах организма. До того как примерно в 2000 г. был секвенирован[44] человеческий геном, мы понятия не имели, сколько генов нужно человеку для выработки всех необходимых белков, благодаря которым мы – это мы. Незнание не мешало нам строить предположения, большинство из которых оказались абсолютно ошибочными.

В заблуждение нас ввели дрожжи. Да, те самые дрожжи, благодаря которым поднимается тесто и бродят пиво и вино. Дрожжи – одноклеточные организмы. У них нет ни мозга, ни сердца, ни рук, ни ног, ни желудка, ни печени, ни кишечника. Нет и репродуктивных тканей. При размножении у них образуется маленькая почка, которая становится все больше и больше, затем отрывается и становится новой клеткой. Поэтому казалось вполне очевидным, что дрожжам для обеспечения жизнедеятельности нужно гораздо меньше генов, чем человеку, состоящему из сотен разных по типу клеток.

Геном дрожжей был секвенирован в 1996 г., он стал первым секвенированным геномом эукариотического организма. И оказалось, что геном дрожжей состоит примерно из 6000 кодирующих белки генов[45][46]. В это время проект «Геном человека» еще только начинался и даже принимались ставки – кто точнее угадает, сколько генов окажется у человека. Конечно, их намного больше, чем у примитивных дрожжей. Известные научные авторитеты на своих лекциях прогнозировали для человека 100 000 и более генов.

Поэтому вы можете представить себе, как были потрясены ученые, когда в 2003 г. наконец была обнародована последовательность генома человека и мы узнали, что у человека примерно 24 000 белок-кодирующих генов[47], то есть всего в четыре раза больше, чем у примитивных дрожжей. Как такое может быть? Казалось, это не согласуется со здравым смыслом. И люди, и дрожжи – организмы, хранящие наследственную информацию в виде ДНК. Почему же у нас генетических возможностей оказалось намного больше, чем у наших грибных родственников, оставшихся на нижней ступеньке?

Ответ в значительной степени связан с «бессмысленными» интронами. У дрожжей в большинстве генов нет интронов, а если есть, то обычно это всего один интрон, а потому сплайсинг РНК может происходить лишь одним способом. Но у человека интроны оказались отнюдь не помехами. Они весьма полезны. С их помощью в РНК могут соединяться разные фрагменты, и в результате при таком же количестве генов удается получить больше разных белков.

Первые примеры такого альтернативного сплайсинга мРНК были обнаружены в 1980 г., вскоре после открытия самого процесса сплайсинга. Альтернативный вариант сплайсинга может совершаться, например, когда вырезается один из кодирующих участков, как показано на рисунке.

Альтернативный сплайсинг мРНК позволяет получить несколько белков одного гена. Поскольку у большинства человеческих генов не менее двух интронов, сплайсинг РНК может происходить разными способами. Сверху: при независимом сплайсинге двух интронов получается мРНК, кодирующая одну из форм белка. В середине: при сплайсинге выпадает один из кодирующих участков, и в итоге у белка отсутствует центральный фрагмент. Внизу: при использовании альтернативного места (сайта) сплайсинга образуются более длинная мРНК и белок с дополнительным фрагментом

Вернемся к нашей условной фразе, но сейчас она будет содержать два интрона: «Вы сегодня очень бла-бла приятно бла-бла-бла-бла-бла пахнете». При обычном сплайсинге вырезаются оба интрона, и окончательный вариант прозвучит так: «Вы сегодня очень приятно пахнете». Но «приятно» может быть выброшено, и тогда «очень» и «пахнете» окажутся рядом. В результате альтернативного сплайсинга фраза станет «Вы сегодня очень пахнете», где есть большинство слов из предыдущей версии, но смысл совершенно иной.

Такой альтернативный сплайсинг, когда из одной фразы получаются несколько фраз, разных по значению, позволяет при ограниченном размере генома вырабатывать более сложный набор белков, что приводит к появлению более сложных организмов[48]. Это важный момент, поскольку за счет альтернативного сплайсинга с одного человеческого гена в среднем получается четыре-пять разных мРНК и белков. Вот она, важная особенность, позволяющая неожиданно малому по размеру человеческому геному сделать нас такими, какие мы есть.

Один из моих любимых примеров альтернативного сплайсинга мРНК можно найти у нас в иммунной системе, а именно в B-лимфоцитах – белых клетках крови. Эти клетки вырабатывают антитела – белки, способные защищать нас от инфекций, распознавая и нейтрализуя патогены, проникшие в наш организм. На ранней стадии жизни В-лимфоцита антитела располагаются на внешней поверхности этой клетки, ожидая появление патогена, для которого опасен охранник именно данного типа. Таким патогеном может быть, например, коронавирус. Затем В-лимфоциты переключаются на выделение антител, которые циркулируют по кровеносной системе и, опять же, связываются с вирусами подходящей формы. В первом случае антитела стоят на страже, во втором – преследуют захватчика.

Эти два типа антител – рецепторы на поверхности клеток и циркулирующие по кровотоку – одинаковы в том участке, которым они прикрепляются к вирусу, но отличаются друг от друга другим концом. У тех, которые прикреплены к В-лимфоциту, гидрофобный конец удерживается в клеточной мембране, а у свободно плавающих антител второго типа конец покрыт углеводной оболочкой[49], позволяющей белку высвободиться из клеточной мембраны и перемещаться с кровотоком. Обе формы кодируются у человека одним и тем же геном. РНК, скопированная с этого единственного гена[50], может подвергнуться сплайсингу двумя способами, так что получатся два лишь частично сходных белка. Сравните: «Вы сегодня очень приятно пахнете» и «Вы сегодня очень пахнете». Благодаря альтернативному сплайсингу можно, таким образом, весьма эффективно использовать один и тот же ген для решения двух разных задач.

Итак, в чем же разница между слоном и кишечной палочкой? В сплайсинге.

Способность животных создавать огромные предшественники мРНК, а затем разрезать и соединять фрагменты для получения нужных мРНК, была ошеломительным открытием. Но то, что ученые открыли сплайсинг, еще не означало, что они поняли, как этот процесс происходит. Предстояло постичь главное: как определяются интроны, которые нужно удалить. Места сплайсинга должны были распознаваться с исключительной точностью, поскольку пропуск даже одного основания приводил бы к сдвигу рамки считывания, изменению всех последующих кодонов и нарушению функции белка.

Джоан Стейц, подобно многим другим ученым, совершившим революционные открытия, воспользовалась несколькими счастливыми случайностями, чтобы понять, как сама природа пометила места сплайсинга. В 1963 г. Джоан поступила в Гарвардский университет на новую там программу по биохимии и молекулярной биологии, оказавшись единственной женщиной среди аспирантов ее потока и первой женщиной-аспирантом[51] в исследовательской группе Джима Уотсона. После защиты диссертации по РНК бактериофагов она вместе с мужем, тоже биохимиком, Томом Стейцем отправилась в Англию, в знаменитую лабораторию молекулярной биологии в Кембриджском университете. Там Джоан сотрудничала с такими учеными, как Фрэнсис Крик и Сидней Бреннер. Потом супруги Стейц работали в Калифорнийском университете в Беркли. Том получил должность профессора, но вскоре стало ясно, что Джоан там сможет работать только в качестве его ассистента. Руководитель кафедры биохимии сказал ей: «Всем нашим женам нравится быть ассистентами у своих мужей»[52]. Поэтому пара быстро переместилась в Йельский университет, где в 1970 г. оба получили независимые профессорские должности.

В Йеле Джоан заинтересовалась длинными РНК, образующимися в ядрах клеток млекопитающих. Оставалось еще несколько лет до открытия интронов, поэтому тогда было непонятно, что длинные РНК – это предшественники мРНК. Джоан хотела получить антитела, которые можно было бы использовать в качестве инструментов для выявления и возможного подавления активности белков, связанных с такими крупными ядерными РНК. В ходе экспериментов крысам вводили соответствующий белок, чтобы иммунная система грызунов, воспринимающая человеческий белок как чужеродный, выработала против него антитела, так же как она это делает для борьбы с вирусами. Попытки Джоан заставить крыс вырабатывать такие антитела были болезненными, причем в буквальном смысле. У нее до сих пор сохранился шрам на пальце в месте крысиного укуса.

В 1979 г. Джоан узнала, что пациенты с системной красной волчанкой – заболеванием, при котором иммунная система человека атакует собственный организм, – вырабатывают антитела к веществам, присутствующим в ядрах их собственных клеток. Может быть, эти антитела распознают белки, связанные с ядерной РНК? Она отправила Майкла Лернара – студента-медика из своей лаборатории – через дорогу, в отделение иммунологии Йельского университета, чтобы добыть от таких пациентов образцы сыворотки с антителами.

Вскоре Джоан и Майкл выяснили, что у больных волчанкой вырабатываются антитела к белкам, связанным с малыми РНК, содержащимися в ядрах собственных клеток[53]. Это было плохой новостью для больных волчанкой – ведь антитела должны, как правило, вырабатываться против чужеродных агентов, а не против компонентов собственных клеток. Но это было хорошей новостью для ученых, потому что такие малые ядерные РНК (мяРНК) помогли понять чудо мРНК-сплайсинга. О существовании мяРНК уже было известно[54]. Всего их насчитывали шесть вариантов, и, поскольку в них много урацила (в РНК он обозначается U), им дали названия от U1 до U6. Но функции мяРНК по состоянию на 1979 г. оставались неизвестны.

К тому времени прошло уже два года с момента сенсационного сообщения в Колд-Спринг-Харбор об интронах, разделяющих гены на кусочки, и уже было найдено множество других интронов у человека. Теперь всем хотелось понять, как клетки контролируют сплайсинг и определяют, какие фрагменты им надо сохранить в мРНК, а какие вырезать. Этот вопрос постоянно обсуждался в лабораториях, изучавших РНК, и в лаборатории Джоан в том числе. Джоан знала, что интроны бывают разных размеров и с разной последовательностью нуклеотидов. Но концы интронов выглядели почти одинаково: все они начинались с ГУААГУ и заканчивались на АГ. Джоан прекрасно понимала, что за счет комплементарности одноцепочечные участки молекул РНК предрасположены к спариванию[55] с одноцепочечными участками других РНК, имеющих соответствующие основания. Поэтому можно было предположить, что одинаковые (консервативные) последовательности на концах интрона могут быть распознаны и помечены как места сплайсинга с помощью соединения с одной из мяРНК. Джоан и Майкл Лернер проверили, есть ли совпадение в последовательностях, и нашли его. Участок на одном из концов мяРНК U1 был комплементарен началу интрона у человека, по крайней мере, так это следовало из их записей. Совпадение казалось слишком удачным, чтобы быть случайным, поэтому исследователи смело предположили вероятность того, что U1 определяет начало каждого интрона[56], помогая сделать разрез именно в этом месте.

Через несколько лет эту гипотезу подтвердили с помощью ряда экспериментов. Например, в лаборатории Фила Шарпа была разработана методика, позволяющая наблюдать за реакцией сплайсинга РНК в пробирке, и в совместной работе группы Фила и Джоан проверяли, будут ли антитела к белку, связанному с мяРНК, подавлять сплайсинг. Если мяРНК U1 действительно распознает место начала сплайсинга, антитела подавят сплайсинг. В результате совместных исследований именно это явление и было обнаружено[57].

За счет комплементарности мяРНК U1 определяет местоположение начала интрона, обозначая, таким образом, место сплайсинга. Комплементарная пара А-У в РНК аналогична комплементарной паре А-Т в ДНК

А как насчет консервативного участка АГ на другом конце каждого интрона? Там ситуация оказалась немного сложнее. МяРНК U2 действительно соединяется с комплементарной последовательностью в конце интрона, но АГ участок распознается благодаря белку, связанному с мяРНК U2[58].

После открытия того факта, что мяРНК участвует в сплайсинге мРНК, в список функций РНК добавилась еще одна: РНК может отмечать нужный участок, подобно тому как можно поставить метку на карте в интернете. Логично было ожидать такую функцию у одноцепочечной РНК, поскольку она всегда готова соединить основания А с У и Г с Ц. Мы наблюдали это уже не впервые: сначала на примере соединения антикодонов транспортной РНК с кодонами мРНК, теперь у мяРНК, присоединяющихся рядом с местом сплайсинга.

Вырезание интронов происходит с поразительной точностью, но ничто в природе не совершенно. Ошибки случаются, и, когда речь идет об интронах, нарушение сплайсинга может повлечь разрушительные последствия.

Обычно если какой-либо биохимический процесс важен для здоровья человека, то существуют заболевания, возникающие при нарушении этого процесса. И действительно, в 1981 г., то есть спустя всего четыре года после того, как был открыт сплайсинг мРНК, нашли первое заболевание, которое может быть вызвано нарушением сплайсинга, – бета-талассемию.

Это одно из самых распространенных генетических заболеваний в странах Средиземноморья, Азии и Ближнего Востока. Больные бета-талассемией страдают от анемии, то есть у них меньше эритроцитов, поэтому организм получает недостаточно кислорода, что приводит к сильной утомляемости и повышенному риску ранней смерти. Белок гемоглобин, который содержится в эритроцитах и переносит кислород, состоит из четырех аминокислотных цепочек: двух одинаковых альфа-цепей и двух одинаковых бета-цепей. Больные бета-талассемией страдают от анемии, потому что в их гемоглобине не хватает бета-цепей. Для другого заболевании, тоже поражающего эритроциты, – серповидно-клеточной анемии – характерна мутация в гене, отвечающем за синтез бета-цепи, но при бета-талассемии иногда в кодирующей части последовательности не находят мутации, которая могла бы объяснить возникновение заболевания.

Шерман Вайсман и его коллеги в Йельском университете заинтересовались случаем двенадцатилетней греко-кипрской девочки[59], которой в ходе лечения от бета-талассемии делали переливания крови. Ученые выделили ген бета-цепи гемоглобина девочки, расшифровали его последовательность и решили загадку: мутация была не в части, кодирующей мРНК, а в интроне. Из-за мутации возникла последовательность АГ, похожая на место сплайсинга, из-за чего система сплайсинга ошибалась и разрезала РНК в неправильном месте. Позднее в том же году исследователи из Лондона убедительно показали, что мутация в интроне приводила к ошибочному сплайсингу мРНК[60]. Всякий раз, когда система сплайсинга сталкивалась с этим мутантным участком, образовывалась аномальная мРНК, которая больше не кодировала бета-цепь гемоглобина. Хотя сплайсинг РНК иногда может быть причиной заболевания, как в этих случаях с бета-талассемией, он способен стать также и средством лечения. Спинальная мышечная атрофия (СМА) впервые была описана врачами в 1890 г. Это разрушительное нейродегенеративное заболевание встречается у одного из 11 000 младенцев, то есть достаточно часто. Дети со СМА страдают от прогрессирующей мышечной слабости и утраты подвижности, и многие из них умирают, не дожив до двух лет. Это генетическое заболевание, вызванное мутацией в гене SMN1 (ген выживаемости моторных нейронов 1)[61]. У здоровых людей на основе гена SMN1 вырабатывается белок, который помогает мяРНК объединяться со своими белковыми партнерами[62]. Поскольку это важно для всех типов клеток, не вполне понятно, почему именно моторные нейроны особенно чувствительны к отсутствию SMN белка, тем не менее это так[63].

Таким образом, если ученые хотят вылечить СМА, им надо придумать, как компенсировать отсутствие белка SMN. Оказывается, в геноме человека часто встречается дублирование генов и существует второй ген выживаемости моторных нейронов, а именно SMN2, кодирующий тот же белок, что и ген SMN1. Важно, что у SMN2 другие интроны. Когда происходит сплайсинг его мРНК, обычно пропускается важный фрагмент кодирующей последовательности и получается нефункциональная мРНК, с которой невозможно получить работающий белок SMN. Но что, если попытаться настроить сплайсинг РНК гена SMN2 так, чтобы он компенсировал невозможность получить нужный белок из-за мутации в гене SMN1?

В 2002 г. Адриан Крайнер из лаборатории Колд-Спринг-Харбор нашел способ восстановить сплайсинг SMN2, чтобы компенсировать неработающий SMN1. Он определил в мРНК гена SMN2 участок, мешающий правильному сплайсингу. Альтернативный сплайсинг мРНК часто регулируется так называемыми факторами сплайсинга – тканеспецифичными белками, которые связываются с конкретными участками на предшественнике мРНК и усиливают или ослабляют вероятность использования определенных сайтов сплайсинга. Эти сайты формировались так, чтобы регулировать сплайсинг у здорового организма, но в данном случае фактор сплайсинга мешал нормальному процессу. Адриан предположил, что если как-то удастся прикрыть или спрятать эту мешающую последовательность, то можно восстановить нормальный сплайсинг SMN2[64].

Чтобы проверить эту идею, Адриан начал сотрудничать с биофармацевтической компанией Ionis в Сан-Диего, которая специализировалась на создании лекарств с использованием антисмысловых РНК. Эти РНК сконструированы таким образом, что содержат последовательности, комплементарные определенной РНК организма. Например, если в мРНК есть последовательность ГГГ, кодирующая аминокислоту глицин, то антисмысловую РНК сделают так, чтобы у нее была последовательность ЦЦЦ. В таком случае антисмысловая РНК будет связываться с заданной РНК за счет комплементарности Г-Ц, механически блокируя присоединение к ней белка.

Адриан совместно с компанией Ionis решили разработать антисмысловую РНК, которая связывалась бы с участком, мешающим правильному сплайсингу РНК гена SMN2, и «скрывала» бы этот участок, а также содержала бы некоторые химические модификации, чтобы облегчить доставку лекарства в нужное место организма. После нескольких лет работы идея получила реальное воплощение[65] и удалось восстановить выработку функционального белка сначала в культуре клеток, а затем у генетически модифицированных мышей с той же мутацией, которая приводит к развитию СМА у человека.

Главной проверкой стали клинические исследования на реальных пациентах. За время изучения этого заболевания Адриан познакомился с семьей на Лонг-Айленде, где у девочки по имени Эмма Ларсон была диагностирована СМА средней тяжести, – ген SMN1 у Эммы частично работал. До года девочка нормально развивалась, потом ей вдруг стало трудно держать бутылочку и даже удерживать голову. Родители Эммы были полны решимости сделать все возможное для своей маленькой, сильной духом дочки и ухватились за возможность включить ее в клинические исследования лекарства на основе антисмысловой РНК.

Мама Эммы рассказывает, что произошло, когда дочке ввели вторую дозу антисмыслового препарата, сейчас известного под названием «нусинерсен»[66]. «Я была в спальне, – вспоминает Диана Ларсон. – Эмма оставалась в другой комнате. Напомню, она не может сама передвигаться дальше чем на несколько футов. Внезапно я слышу, что ее голос раздается все ближе и ближе. Что она делает? "Эмма?" – говорю я. В следующий момент я понимаю, что она рядом со мной на полу спальни, прямо у двери. Я была потрясена! Я не могла поверить, что она проделала весь этот путь из другой комнаты»[67].

Нусинерсен оказал положительное влияние не только на Эмму, но и на других участников клинических испытаний. Результат был настолько хорош, что Администрация по контролю за продуктами питания и лекарственными препаратами[68] завершила испытания на год раньше срока и одобрила препарат. К 2020 г. нусинерсен получали 8 000 больных СМА в 40 странах. Он не дает излечения: ведь к тому моменту, когда применяется препарат, нейроны уже получают необратимые повреждения. Но он спасает жизни. В будущем хотелось бы выявлять данный генетический дефект еще у новорожденных и начинать лечение сразу же, предотвращая развитие СМА.

Успешное применение нусинерсена вызвало повышенный интерес к антисмысловым препаратам и к их способности направлять сплайсинг РНК нужным образом. Например, мышечная дистрофия Дюшенна – изнурительное генетическое заболевание с прогрессирующей потерей мышечной функции из-за отсутствия критически важного белка дистрофина. Состояние пациента, страдающего этим заболеванием, может быть улучшено, если изменить характер сплайсинга РНК и получить таким образом недостающий белок[69]. И, напротив, многие распространенные виды рака, такие как рак поджелудочной железы, легких и толстой кишки, связаны с патогенным белком, поэтому антисмысловые РНК, подавляющие сплайсинг, потенциально могут остановить выработку такого вызывающего рак белка и предотвратить развитие болезни. Как мы увидим дальше, многие заболевания у людей стимулируются патологическими процессами, сопряженными с РНК. Поэтому у терапии с использованием антисмысловых РНК в будущем большие перспективы.

С открытием сплайсинга стало ясно, что матричная РНК не всегда представляет собой непосредственную копию информации, хранящейся в двойной спирали ДНК. У высших организмов, в том числе у человека, для получения мРНК сначала происходит точное копирование всей информации с ДНК, включая большие участки интронов, которые не войдут в итоговую молекулу. Затем в процессе сплайсинга РНК интроны вырезаются, кодирующие участки соединяются вместе и образуется мРНК, которая выходит из клеточного ядра и взаимодействует с рибосомами. На первый взгляд этот процесс кажется чудовищно неэффективным: зачем природе прерывать кодирующие участки интронами, чтобы потом вырезать их из РНК? Но у всех этих фокусов есть большой смысл. Возможность альтернативного сплайсинга придает геному ограниченного размера непредставимую ранее гибкость и помогает нам стать теми, кто мы есть.

При изучении механизмов сплайсинга выяснилось, что в репертуаре РНК есть еще дополнительные трюки. Так, малые ядерные РНК необходимы для точной маркировки мест сплайсинга. Эти мяРНК наряду с транспортными и рибосомными РНК, играющими важнейшую роль в биологии клетки, были причислены к группе так называемых некодирующих РНК. Но впереди было нечто гораздо большее. Вскоре ученые выяснили, что некодирующие РНК способны не только участвовать в синтезе белка и маркировать нужное место. Они могут сами управлять происходящим. Во многих важных клеточных процессах РНК действует как катализатор.

Что заставляет нас «включаться» и работать? Что нас, так сказать, заводит? Ответ однозначен: ферменты. Эти вещества обеспечивают биохимические реакции во всех живых организмах. Они обязывают наше сердце биться, желудок – переваривать пищу, они расщепляют алкоголь, который мы пьем. Кроме того, ферменты также синтезируют каждый кусочек каждой клетки в теле, будь то вещества внеклеточного матрикса, скрепляющего наши клетки, или хромосома, где находится аккуратно упакованная молекула ДНК, или липидная оболочка – клеточная мембрана. Ферменты начинают вечеринку под названием «жизнь».

Если использовать химические термины, можно сказать, что ферменты ускоряют, или катализируют, реакции. Это звучит довольно обыденно, пока вы не осознали их потрясающую мощь. Они могут увеличить скорость естественной реакции двух веществ в 10 млрд раз. Процесс, который с участием фермента проходит за секунду, при его отсутствии будет длиться 317 лет. На человека работает около 10 000 разных ферментов. И хотя некоторые ферменты у нас уникальны, многие другие, обеспечивающие жизнедеятельность организма, так называемые «белки домашнего хозяйства», найдены у множества видов, от тигров до мухоморов. Они необходимы для поддержания работоспособности наших организмов.

Еще в XIX в. естествоиспытатели наблюдали в пробирках результат работы ферментов. Немецкий химик Эдуард Бухнер показал, что клетки дрожжей содержат фермент зимазу, который превращает раствор сахара в этиловый спирт и углекислый газ, выделяющийся на поверхность в виде пузырьков. Всем нам этот процесс известен как брожение.

Ученые очень давно заметили, что процессы, катализируемые ферментами, чрезвычайно специфичны. То есть, в отличие от обычных беспорядочных химических реакций, фермент очень избирателен, так что вступают в реакцию и образуются в результате нее строго определенные вещества. Исследователи измеряли скорость ферментативной реакции и могли предсказать ее изменения, например, при добавлении зимазы или сахара. Целые книги подробно описывали работу ферментов[70]. Однако примечательно, что научному сообществу не удавалось точно решить, из чего они состоят[71]. Это стало предметом долгих и противоречивых научных изысканий. На определенных этапах работа напоминала поиск вещества наследственности, завершившийся в итоге открытием двойной спирали ДНК. Как монах-августинец Грегор Мендель знал, что должна существовать некая дискретная единица наследственности, управляющая признаками его гороха, но не представлял, из чего она состоит, так и ученые знали, что существует мощное вещество, ускоряющее биохимические реакции, но не могли прийти к единому мнению, что это такое.

Джеймс Самнер занялся химией после того, как в юности он в результате несчастного случая на охоте потерял руку. В 1920 г. он предложил необычную для того времени теорию, согласно которой ферменты – это белки. В своей лаборатории в Корнеллском университете Самнеру удалось выделить и затем кристаллизовать фермент уреазу, который расщепляет мочевину (вещество в моче) на аммиак и углекислый газ. Как известно, кристаллы химически очень чистые; например, в кристаллах поваренной соли, которой вы посыпаете свой бургер, содержится чистый хлорид натрия. Когда анализ кристаллической уреазы показал, что она представляет собой чистый белок и сохраняет свою ферментативную активность, Самнер пришел к логичному выводу, что по своей природе этот фермент – белок. Но все равно по отношению к такому утверждению оставались скептики. Впрочем, в последующие три десятилетия парадигма менялась, по мере того как множество других ферментов были кристаллизованы и также оказались белками. В своей нобелевской лекции в 1946 г. Самнер без колебаний объявил то, что все уже приняли как факт: «Все ферменты – это белки»[72].

Через тридцать лет я, молодой исследователь, изучающий РНК, столкнулся с вопросом, может ли это фундаментальное положение быть в корне неверным. Если ответ утвердительный, то мне с другими учеными придется рассматривать РНК совершенно по-новому – не как переносчика информации от ДНК и пассивного участника синтеза белка, но как катализатор, который может управлять биологическими процессами.

В 1978 г., после окончания моей постдокторантуры в Массачусетском технологическом институте, я перешел на место профессора в Колорадский университет в Боулдере. Мне выделили исследовательскую лабораторию на третьем этаже весьма старомодного здания, где размещался химический факультет. Я собирался заниматься передовыми научными изысканиями, хотя лаборатория была как из XIX столетия, с потертыми столешницами из черного камня талькохлорита и лакированными дубовыми ящиками. Тем не менее в этой лаборатории я впервые работал в качестве самостоятельного ученого, поэтому она казалась мне великолепной.

Когда я оглядывал эту пустую комнату, то еще не имел ни малейшего представления о том, что мне предстояло открыть. Однако я понимал, что мне нужна помощь, поэтому первым делом решил пригласить на работу лаборанта-исследователя. На мое объявление в The Denver Post откликнулось около 30 кандидатов, но только у одного в рекомендательном письме было сказано: «У него золотые руки. Все эксперименты, которые он проводит, результативны». Арт Зауг работал в Уэслианском университете в штате Коннектикут, поэтому я проводил собеседование по телефону. И хотя я не мог предложить ему ни высокой зарплаты, ни гарантий длительной занятости, он принял мое предложение и переехал в Колорадо, чтобы начать работу с моим новым микроскопическим подопытным кроликом – тетрахименой (Tetrahymena), одноклеточным существом, обитающим в прудах.

В то время я, как и большинство биологов на Земле, все еще считал РНК своего рода посредником, играющим вторую скрипку при ДНК. Я был специалистом по ДНК: моя диссертация и последующая работа были посвящены двойной спирали. Однако в ходе исследований я все больше приближался к РНК. Когда я приехал в Боулдер, то пытался разобраться, как РНК копирует ДНК в процессе транскрипции. Клеточные ферменты превращали последовательность ДНК в РНК подобно тому, как средневековые монахи переписывали библейские тексты на чистый пергамент.

Общие принципы транскрипции были уже хорошо изучены на бактериях. Я же пытался понять, как транскрипция происходит у эукариотов – организмов, хранящих свою ДНК в ядре. Об этом я рассказал Арту, вводя его в курс дела. Множество фундаментальных исследований эукариотических клеток были выполнены на дрожжах, мушках дрозофилах или мышах, чьими генами легко управлять, либо на клетках и тканях человека, потому что это имеет медицинскую значимость. Меня не прельщали ни дрожжи, ни мушки, ни мыши, потому что каждый ген у них один из многих тысяч, настоящая иголка в стоге сена. А я хотел изучать единственный ген и его природных белковых партнеров, поэтому мне нужен был эукариотический организм, более подходящий для этой задачи.

И тут на сцену выходит тетрахимена – одноклеточный волосатый комочек, встречающийся в пресноводных прудах по всему миру. По форме она напоминает крошечный арбуз, покрытый ресничками, как шерстью. Она немного похожа на хомячка без мордочки и очень мило смотрится под микроскопом. Клетки тетрахимены очень быстро растут и делятся каждые три часа, следовательно, каждые три часа клетка должна удвоить количество содержащихся в ней белков. Для совершения такого подвига должно быть достаточное количество молекулярных фабрик белка – рибосом, поэтому каждая клетка тетрахимены содержит около 10 000 копий генов рибосомной РНК[73]. Сравните 10 000 копий одного гена с типичными для человека двумя копиями (одна от мамы, другая от папы), и вы поймете, почему эта малышка привлекла мое внимание. Гораздо проще найти иголку в стоге сена, если таких иголок там 10 000. У генов рибосомной РНК тетрахимены есть еще одна удивительная особенность. По какой-то неведомой причине они находятся на коротких фрагментах ДНК, а не располагаются бок о бок с другими генами как часть гигантской хромосомы. Поэтому можно выделить гены рибосомной РНК неповрежденными, что практически нереально при работе с хромосомами человека, которые длиннее в тысячи раз[74]. Казалось, ДНК тетрахимены лежала упакованная и перевязанная ленточкой в ожидании ученых, которые придут и заберут этот подарок.

Нашей целью было понять, как РНК транскрибируется с гена тетрахимены и как специальные белки эукариотических хромосом, связанные с ДНК, регулируют этот процесс. Арту с его золотыми руками не потребовалось много времени, чтобы начать работу. Он проводил эксперименты с изумительной точностью, оказавшись, таким образом, ценным помощником для студентов. Вскоре они выстраивались в очередь, чтобы использовать его буферные растворы, ведь все знали, что раствор, приготовленный Артом, точно будет работать, а раствор, сделанный ими самостоятельно… должен бы работать. Когда кто-то в лаборатории готовил свои результаты к публикации, он мог попросить Арта воспроизвести ключевой эксперимент «в последний раз», потому что, какими бы точными ни были их собственные данные, результаты Арта будут безупречны.

Вскоре мы обнаружили, что изучаемый ген тетрахимены содержит один небольшой интрон, длиной около 400 пар оснований[75]. Сначала мы решили, что это просто еще один случай, когда бессмысленное «бла-бла-бла» прерывает важные значимые участки гена, аналогично тому, что двумя годами ранее Фил Шарп и Рич Робертс описали для мРНК. У нас были рибосомные РНК (рРНК), а не мРНК, но мы полагали, что в общих чертах это одна и та же схема. И хотя ученые не могли прийти к единому мнению, откуда в гене взялись интроны, мы были уверены, что их необходимо оттуда удалить. Всякий раз, когда ген копировался в виде РНК, интрон необходимо было аккуратно вырезать, чтобы получить функциональную молекулу РНК, независимо от того, была ли это мРНК, кодирующая белок, или рРНК, которая входит в состав синтезирующей белок рибосомы.

Как специалиста по ДНК меня не особо интересовали интроны. Вместо этого я старался понять процесс транскрипции. Наш первый вопрос был простым: можем ли мы с Артом наблюдать, как РНК копируется с ДНК?

В первых экспериментах мы не стали физически изолировать гены рибосомной РНК тетрахимены. Вместо этого мы использовали волшебный грибной соус. Арт выделил ядра из клеток тетрахимены и добавил к ним немного токсина из красивого мухомора с красной шляпкой. Конечно, этому ингредиенту не место в говядине по-бургундски, но для нашей биохимической кухни у него были полезные свойства. Этот токсин отравлял РНК полимеразы – ферменты, которые производят мРНК и тРНК, но не трогал фермент, синтезирующий рРНК. Таким образом, мы могли быть уверены, что любые РНК, образующиеся в нашей пробирке, будут синтезированы только с генов рРНК. В наше биохимическое блюдо также были добавлены радиоактивные нуклеотиды, которые встраивались в любые синтезированные в ядре молекулы РНК, что позволяло отслеживать РНК на протяжении всего эксперимента. Затем мы смешали всё вместе и оставили пробирки на час, чтобы успела образоваться РНК.

После этого Арт использовал электрофорез в геле для анализа полученной РНК. Гель представляет собой фрагмент желеобразной (студенистой) субстанции; когда в нем создается электрическое поле – а именно отрицательный электрод размещается сверху, а положительный снизу, – отрицательно заряженные молекулы РНК протискиваются сквозь гель. Мелкие молекулы способны прокладывать себе путь через гель быстрее, чем крупные, поэтому молекулы РНК одинаковых размеров группируются в геле в виде отдельных полосок.

Затем Арт убрал гель в темную комнату, положил на него лист рентгеновской пленки, оставил на ночь и следующим утром проявил. На пленке появилось изображение, поскольку молекулы РНК были помечены радиоактивными изотопами и каждая полоска РНК засвечивала соответствующий участок пленки. То есть ту же пленку, с помощью которой врач может определить, сломана ли у вас кость, используют и для получения изображения РНК в геле.

Мы с Артом надеялись увидеть рибосомную РНК, и действительно, на рентгеновской пленке она была заметна в виде темной полоски. Но мы с удивлением обнаружили и значительно меньший участок РНК, длиной около 400 оснований. Что это могло быть? Еще несколько экспериментов, и Арт точно установил, что это был интрон РНК, который каким-то образом «выпрыгнул» из большой РНК, образовавшейся в нашей пробирке в результате транскрипции.

Внезапно наш интерес к интронам резко возрос. В то время ученые активно задавались вопросом, как именно интроны вырезаются из РНК, а нам, видимо, посчастливилось запечатлеть этот процесс в действии. Чтобы понять механизм любого биохимического процесса, надо прежде всего заставить его протекать вне организма, то есть в лабораторной пробирке, где можно контролировать все компоненты реакции. Чтобы этого добиться, часто требуются годы, но у нас сплайсинг РНК тетрахимены происходил каждый раз, когда мы синтезировали РНК. Казалось, РНК отвела нам места в первом ряду, чтобы мы могли наблюдать за спектаклем сплайсинга.

Мы подумали, что сплайсинг катализируется белковыми ферментами. Ведь вырезанный интрон был всегда одинаковой длины, что предполагало работу очень точного фермента, а, как утверждал Самнер, «все ферменты – это белки». Поэтому мы с Артом разработали эксперимент, который позволял бы найти фермент или ферменты, поскольку их могло быть два: один вырезал интрон, другой склеивал полезные фрагменты РНК вместе. Мы знали, что сплайсинг совершается внутри ядра тетрахимены. И знали, что сплайсингу подвергается новообразованная РНК. Итак, для начала мы сумели выделить РНК перед тем, как пройдет сплайсинг, чтобы в этих молекулах еще оставались интроны. А затем взяли пробирку и смешали там несплайсированную РНК и разрушенные ядра тетрахимены. Мы запустили РНК в гель и наблюдали сплайсинговую активность с помощью рентгеновской пленки.

Когда Арт впервые попробовал провести этот эксперимент, мы с восторгом увидели, что интрон, размером в 400 оснований, вырезается из большой молекулы рРНК. Для науки это было непривычно – так быстро воссоздать естественный процесс в лабораторных условиях. Нашему другу Джону Абельсону из Калифорнийского университета в Сан-Диего потребовалось четыре года изнурительной работы, чтобы получить сплайсинг мРНК дрожжей в пробирке[76].

Но что-то здесь было не так. Как и любой опытный ученый, Арт предусмотрел ряд проверочных действий, которые помогали убедиться, что наблюдаемая реакция проходит надлежащим образом. В хорошем контрольном эксперименте исключают один из компонентов биохимического рецепта, оставляя все остальное без изменений. Если бы экспериментом было выпекание кекса, то в качестве контроля можно было бы исключить только муку, только яйца или только шоколад. Довольно скоро пекарь убедился бы, что мука и яйца – необходимые компоненты, а шоколад – дополнительный, что укрепило бы его представления о себе как о человеке, понимающем, что нужно, чтобы испечь кекс. В эксперименте Арта со сплайсингом РНК хорошим способом контроля было исключить ядра тетрахимены из реакции, потому что именно они, предположительно, служили источником белков, катализирующих реакцию сплайсинга. Мы ожидали, что в опыте без ядер ничего не произойдет. Однако удивительным образом сплайсинг сохранился. На рентгеновской пленке отпечатывалась яркая и четкая полоска, соответствующая интрону в 400 оснований, так, словно для сплайсинга не требовалось никакой помощи ферментов.

Первоначальный эксперимент по поиску ферментов, катализирующих сплайсинг рибосомной РНК у тетрахимены, дал неожиданный результат. Предполагалось, что для сплайсинга РНК требуется добавление экстракта ядер, где содержатся ферменты сплайсинга, но с помощью электрофореза в геле (методики, позволяющей разделить мелкие и крупные фрагменты РНК) было выявлено, что сплайсинг РНК происходит как в присутствии экстракта (правая дорожка), так и без него (средняя дорожка). Возник вопрос: чем же катализируется эта реакция в отсутствие фермента?

Это было не просто странно – это было неслыханно. Откройте любой учебник того времени для старшеклассников или для студентов колледжа, и вы узнаете, что только белковые ферменты катализируют реакции в клетке. Удивительно, но у нас этот процесс шел там, где присутствовала лишь РНК. Так ли это? Следующий год я все еще сомневался: вдруг какой-либо белковый фермент тетрахимены остался соединенным с РНК во время ее очистки – и как раз он отвечал за проведение сплайсинга, который мы наблюдали в наших пробирках. Если наша РНК была загрязнена белком, то нам, конечно, нельзя было утверждать, что РНК может катализировать свой собственный сплайсинг. Возможно, нам просто нужно было найти способ избавиться от гипотетического белка, и тогда РНК перестала бы самостоятельно сплайсироваться, а мы могли бы вернуться к поиску фермента сплайсинга.

В тот момент я поступил так, как должен поступать любой хороший ученый, – я направился туда, куда указывали результаты. Эта дорожка вскоре привела меня в маленький мир науки о РНК. Из специалиста по ДНК я должен был стать специалистом по РНК. Тогда я еще этого не понимал, но такой прыжок с корабля стал важнейшим решением в моей жизни.

Пока мы с Артом продолжали исследовать реакцию сплайсинга, новая аспирантка нашей лаборатории Пола Грабовски сделала еще одно неожиданное открытие. Мы все еще сомневались, что РНК действительно может заниматься сплайсингом самой себя, но Пола получила не менее странный результат. Парадоксально, но, когда появилось второе наблюдение, которое тоже казалось чем-то космическим, мы успокоились, поскольку стало ясно, что мы не были некомпетентными или сумасшедшими.

Пола не собиралась находить что-то новое, скорее, новое само нашло ее. Она решила запустить реакцию сплайсинга РНК при температуре 39 °C, а не при стандартных 30 °C. Тетрахимена может расти при обоих значениях температуры. Но теперь вместо одного вырезанного интрона Пола увидела два. И с интроном нового вида происходило нечто странное. В ходе электрофореза в геле новый интрон двигался крайне медленно. Создавалось впечатление, что этот фрагмент РНК был необычной формы, из-за чего и замедлялось его перемещение в геле.

Своим поведением во время электрофореза интрон определенно напоминал кольцевую или, возможно, разветвленную молекулу, хотя кольцевые РНК встречались редко и считалось, что они характерны только для вирусов или для похожих на вирусы инфекционных РНК. Пола получила ряд данных в пользу того, что новый интрон действительно был кольцевой формы. Но мы не могли утверждать это со всей определенностью, пока не увидели кольцевую РНК хотя бы мельком в электронный микроскоп. А поскольку я был единственным в лаборатории специалистом по этой технике, задача легла на меня.

К тому времени прошло уже два года, как я организовал лабораторию и принял на работу Арта. Весь день я был занят преподаванием, поэтому в лаборатории работал в основном по ночам. Я зафиксировал полученные Полой образцы РНК на диски диаметром 3 мм с медной сеточкой и забронировал вечернее время для работы на одном из университетских электронных микроскопов. Когда я включил в темной комнате высоковольтный регулятор, флуоресцентный экран осветил мое лицо зеленоватым сиянием, как на Хэллоуин. Я заглянул в окуляр и с восторгом увидел маленькие пончики – крошечные колечки РНК, покрывавшие сеточку[77]. Увидеть – значит поверить! Надо признаться, кольцевая РНК интрона в то время казалась скорей диковинкой, а не научным прорывом. Потребовалось много работы, прежде чем мы поняли ее значимость.

Тем летом меня пригласили выступить с докладом о моих новых исследованиях, относящихся к РНК, на престижной конференции по нуклеиновым кислотам в Нью-Хэмпшире. Это была редкая возможность для старшего преподавателя. Во время отъездов я всегда звонил в лабораторию, чтобы быть в курсе экспериментов и при случае помочь советом. Когда я разговаривал с Полой на следующий день после приезда, то ощутил в ее голосе скрытое волнение. Пола выделила линейную форму интрона тетрахимены сразу после того, как он был вырезан из большой РНК. Она обнаружила, что, пока интрон находился в пробирке, он сам по себе начинал сворачиваться в кольцо. Во всех предыдущих исследованиях требовалось, чтобы заставить РНК свернуться в кольцо, добавить белковый фермент, который склеивал два конца молекулы. Замыкание (кольцевание) не происходило самопроизвольно.

Я не готов был разделить с Полой ее воодушевление, а реагировал скорее недоверчиво и слегка раздраженно. Стоит ли обращать внимание на слова неопытной аспирантки, явно говорившей о чем-то совершенно нереалистичном и связанном, очевидно, с какой-то грубой ошибкой? Тем более накануне моего выступления перед глубокоуважаемым научным сообществом? Я совершенно не собирался в предстоящем докладе упоминать эти нелепые новые данные.

Однако, вернувшись в Боулдер, я убедился, что казавшийся невероятным результат Полы не был случайным. Он был полностью воспроизводим. Таким образом, в моей молодой лаборатории были получены два результата, которые опровергали все учебники: по-видимому, РНК сама себя выреза́ла в отсутствие какого-либо явного источника ферментов, а вырезанный интрон сам по себе сворачивался в кольцо, опять же в отсутствие каких-либо ферментов. Как такое могло происходить?

К концу 1981 г. мы понимали реакции сплайсинга и циркуляризации РНК вплоть до поведения отдельных атомов фосфора и кислорода[78]. Но с катализатором мы оказались точно в такой же ситуации, в какой были специалисты по ферментам в 1917 г. до работы Джеймса Самнера. Мы знали, что происходит, но совершенно не представляли почему. Чтобы РНК могла самопроизвольно вырезаться и затем сворачиваться в кольцо, процесс должен был длиться несколько тысяч лет. И даже тогда это не совершалось бы с такой высокой точностью, какую мы наблюдали. Должен существовать катализатор.

Как вскоре выяснилось, он был прямо перед нами.

В тот год на рождественской вечеринке химического факультета Пола подарила мне маленький собственноручно сделанный сувенир. Это была пластмассовая ромашка, на лепестках которой она аккуратно вывела чередующиеся надписи: «Это белок» и «Это не белок». В этом и заключалась наша дилемма.

РНК, которую мы использовали в наших экспериментах, прошла этапы тщательной очистки от белков. Эта хорошо известная процедура похожа на очистку одежды от трудновыводимых пятен. Мы стираем одежду в горячей воде, потому что высокая температура разворачивает и делает неактивными белковые цепочки. Мы используем моющие средства, которые тоже разворачивают белки. Мы можем даже обработать одежду стиральным порошком с биологически активными добавками, потому что есть хорошо известные ферменты, которые разрушают любой другой встретившийся белок. Наша РНК прошла все эти этапы и все равно продолжала вырезаться и сворачиваться в кольцо. Все доказательства опровергали гипотезу, что наши образцы были загрязнены каким-то белком. Однако, понимал я, как только мы заявим, что в пробах нет белков и сама РНК способна выполнять эти трюки, сразу найдется скептически настроенный коллега, который заявит, что он или она когда-то слышали о белке, способном пережить все воздействия, используемые нами при очистке.

Гадание на ромашке не тот способ, который позволит ответить на вопрос, нужен ли для сплайсинга рибосомной РНК тетрахимены белковый фермент

Чтобы мы могли уверенно исключить загрязнение тетрахимены белками, нужно было без ее участия создать не подвергшуюся сплайсингу РНК с интронами. Если бы в искусственно созданной РНК сплайсинг проходил в тех же самых местах молекулы, что и в живой клетке, то мы могли бы заявить, что эта РНК сама себе катализатор. И если бы это оказалось правдой, то могло бы перевернуть наши представления не только о химической природе ферментов, но и о способностях РНК.

В то время генная инженерия только зарождалась, и наша лаборатория еще не освоила эту технологию. Нам нужно было провести такие же манипуляция с генами, которые теперь используют биотехнологические компании, когда создают новые лекарственные препараты. Мы должны были обмануть бактерию кишечной палочки E. coli, так чтобы она синтезировала ген рибосомной РНК тетрахимены. Для этого встроили ДНК тетрахимены в плазмиду – маленькую кольцевую молекулу ДНК, которая может реплицироваться в бактериальной клетке. Таким образом мы превратили E. coli в чашках Петри в своего рода генетический копировальный аппарат, дающий столько копий нужного гена, сколько нам необходимо для работы.

Ныне для проведения такого эксперимента аспиранту в моей лаборатории потребовался бы день, но в 1982 г. доведение процесса до совершенства заняло у нас много месяцев. После того как мы наконец получили безупречно чистый ген, который никогда не бывал внутри клетки тетрахимены, нам еще требовалась РНК-полимераза, чтобы преобразовать генетическую информацию в РНК. Мне повезло, что моя жена Кэрол была специалистом по очистке E. coli РНК полимеразы. И она дала недостающий компонент. (Иногда полезно быть женатым на коллеге-биохимике, хотя, уверен, Кэрол поделилась бы этой штукой, даже не будучи моей женой.)

После того как Арт Зауг синтезировал РНК с искусственно созданного гена, он с помощью отточенной до совершенства процедуры избавился от единственного белка, который мы добавили в эксперименте, – РНК-полимеразы. Затем поместил все необходимые компоненты в нужной концентрации в пластиковые пробирки и запустил реакцию сплайсинга. Опять же, это немного напоминает выпечку: у вас есть рецепт, где перечислены мука, сахар, яйца, разрыхлитель и вода. В нашем случае в рецепт входили РНК, некоторые общие для всех клеток соли и один из четырех составных элементов РНК гуанозин – буква Г в алфавите РНК. Как и прежде, продукты реакции РНК были разделены с помощью электрофореза в геле и проявлены на рентгеновской пленке.

Мой друг профессор Ян Энгберг из Копенгагена, который несколько лет назад помог мне познакомиться с тетрахименой, по случаю навестил нас в Боулдере, как раз когда мы проводили эксперимент и проверяли, может ли искусственно созданная бактериальная версия РНК тетрахимены повторить свой трюк. Я до сих пор помню реакцию Яна, когда он увидел только что проявленную пленку. Интрон длиной 400 оснований вырезал сам себя из РНК большего размера, образовав четко различимую полосу на геле. На этот раз мы были уверены, что тут не задействован никакой белковый фермент[79]. Голос Яна чуть сел, он поднял глаза и произнес со своим чудесным датским акцентом: «Вы это сделали».

Теперь настало время повеселиться. Как нам следовало назвать эту удивительную РНК? Я выделил на лабораторной доске место для конкурса названий, и за неделю там появилось множество вариантов. Среди них была неизбежная sexРНК (от англ. self-excising – «самовырезающаяся РНК»). Также был «циркулон» – новый супергерой, способный превращать себя в кольцо. Затем предлагали «АРНзим» – от французской аббревиатуры для РНК – ARN (Acide ribonucléique) – и «энзим» (синоним слова «фермент»), чтобы получить составное слово, которое произносить легче, чем «РНАзим»[80]. Один вариант был явно лучше прочих – рибозим, рибонуклеиновая кислота с энзимной (ферментативной) активностью. Тот факт, что эта РНК не только вырезала себя, но и сворачивалась в кольцевую форму, убедил нас, что она действует как фермент и у нее достаточно мощности, чтобы продолжать работать даже после окончания реакции сплайсинга.

Конечно, было дерзостью с нашей стороны взять такой обобщающий термин. У нас был лишь один пример, а мы выбрали название для целого класса веществ. Но я не видел в этом особой опасности. Если второго примера так и не найдут, то наше открытие останется занятным исключением, и неважно, как мы его назвали. А вдруг тетрахимена явила всему миру лишь первый образец большой группы активных молекул РНК?

Потребовалось совсем немного времени, чтобы ответить на наш вопрос утвердительно. Не прошло и нескольких месяцев после нашей публикации в декабре 1982 г. о самосплайсирующейся РНК, как я услышал, что коллеги из Сент-Луиса, Амстердама и Олбани открыли интронные рибозимы у грибов[81], пекарских дрожжей[82] и даже вирусов-бактериофагов[83]. Последнее противоречило «правилу», согласно которому РНК-сплайсинг характерен только для эукариотов. Как только ученые узнали о существовании РНК, катализирующих свои собственные реакции, они начали находить их повсюду в природе.

Казалось, РНК, способные к самосплайсингу, разрушали одно из главных положений в биологии – что все ферменты являются белками. Нельзя тем не менее сказать, что Самнер был так уж далек от истины. Большинство ферментов действительно белки. Вместе с тем благодаря всем этим РНК с самосплайсингом возникло предположение, что в древности, до наступления эры белков, катализаторами были именно рибозимы.

Возникла также и другая гипотеза: возможно, в природе могут существовать еще не открытые РНК-катализаторы, осуществляющие разнообразные и поразительные реакции, считавшиеся прежде уделом исключительно белков. И действительно, буквально в двух шагах ждал своего открытия совершенно иной тип РНК-катализатора.

В отличие от богини Афины, которая появилась из головы Зевса полностью сформированной и во всеоружии, молекулы РНК транскрибируются с ДНК не сразу в активной форме. Прежде чем приступить к работе, они должны пройти ряд преобразований, или процессинг. Сплайсинг, при котором вырезаются интроны и соединяются оставшиеся участки, пусть и впечатляющая, но лишь одна из реакций РНК-процессинга. Другие события процессинга происходят на концах свежесинтезированной РНК или рядом с ними. При этом могут удаляться ненужные последовательности и добавляться нуклеотиды, не закодированные в ДНК.

Хороший пример такой обработки – транспортная РНК, адаптер, который одним концом распознаёт кодон на мРНК, а на другом несет соответствующую аминокислоту. В изначальной молекуле, полученной в результате транскрипции, присутствует дополнительный участок РНК в начале последовательности, который необходимо отрезать, с точностью до конкретного основания, чтобы получить функциональную тРНК. Фермент, который разрезает РНК, называется рибонуклеаза (или РНКаза), а тот фермент, который отрезает дополнительный участок тРНК, – рибонуклеаза P (где P – от англ. processing). РНКазу P открыл Сидни Олтмен, когда он был постдоком в английском Кембридже и работал в той самой лаборатории, которая дала нам Фрэнсиса Крика и Сида Бреннера.

Рибонуклеаза P, которая у кишечной палочки состоит из молекулы РНК (показана на рисунке) и связанных с ней белков (не показаны), расщепляет молекулу – предшественник тРНК в определенном месте, чтобы получился правильный конец тРНК

Позже в своей собственной лаборатории Йельского университета Сид Олтмен продолжил изучение РНКазы P. Она оказалась очень любопытным ферментом. Всякий раз, когда его выделяли из кишечной палочки, используя технологии для очистки белков, которые совершенствовались на протяжении десятилетий, в ферменте присутствовали надоедливые молекулы РНК. Аспиранту Сида Бену Старку пришлось очищать РНКазу P для своей диссертации. Над ним много подшучивали из-за того, что он не мог убрать РНК из выделяемого фермента[84]. Ведь все ферменты – белки, а грамотный аспирант должен уметь выделить чистую РНКазу P без примесей РНК. Однако Старку хватило опыта и уверенности в себе, чтобы отвергнуть мысль о некомпетентности, и в итоге он провел эксперименты, которые убедили Сида и диссертационный совет, что РНК – необходимый компонент для ферментативной активности РНКазы P[85]. Когда удалось получить отдельно РНК и белок, то оба эти компонента потребовалось опять смешать, чтобы фермент смог снова разрезать тРНК. В тот момент ученые думали, что не переписывают главное правило о ферментах, а лишь дополняют его. Они считали, что именно белковый компонент системы, а не РНК отвечает за протекание реакции.

Так зачем же РНКазе P нужны и белок, и РНК[86]? Разобраться в этом помогла счастливая случайность. Лаборатория Олтмена совместно с лабораторией Нормана Пейса в Колорадо провели ряд экспериментов по молекулярному комбинированию. Сид выделил РНК и белок из РНКазы P кишечной палочки, а Норман выделил те же два компонента из ее довольно дальней родственницы – сенной палочки (Bacillus subtilis). Ученых интересовало, будут ли обладать ферментативной активностью межвидовые комбинации, например РНК из кишечной палочки вместе с белком из сенной палочки. Решающий эксперимент был проведен научным сотрудником лаборатории Сида Сесилией Герье-Такада в пятницу, 23 сентября 1983 г. Сесилия была прекрасным ученым и при работе добавила несколько контрольных опытов, так же как сделал Арт в моей лаборатории. И, главное, она решила перепроверить отдельно реакции РНК-компонента и белка, которые раньше давали отрицательный результат. Она была уверена, что и сейчас не последует никакой активности[87].

Однако в этот раз все было по-другому. Норман по телефону предложил Сиду добавить немного больше хлорида магния – обычной соли, которая встречается во всех живых клетках[88]. Многие повара, увидев рецепт в кулинарной книге, могут его немного поменять и посмотреть, станет ли пирог вкуснее, если добавить пару лишних яиц или положить чуть меньше сахара. Так и Сесилия наряду со стандартным протоколом попробовала вариант с чуть измененными условиями. Она смешала молекулу – предшественник тРНК с разными РНК и белковыми компонентами РНКазы P, затем с помощью гель-электрофореза отделила от других продуктов реакции предшественник тРНК, положила на гель рентгеновскую пленку и оставила всё на ночь.

Когда в субботу она проявила пленку, то увидела, что, как обычно, предшественник тРНК был разрезан в нужном месте РНКазами P, взятыми и у кишечной палочки, и у сенной палочки. Она получала такой результат десятки раз. Но затем – о чудо! В растворе из пробирки, содержавшей только РНК-компонент РНКазы P, без белкового партнера, с доброй щепоткой магниевой соли, произошла точная обрезка предшественника тРНК[89]. То есть РНК сама по себе проявляла свойства фермента, в то время как отдельно белковый компонент был неактивен.

Немедленно осознав революционное значение своего результата, Сесилия, прежде чем рассказывать о нем кому-либо, решила удостовериться, все ли корректно. Она поставила повторный эксперимент в ту же субботу, чтобы убедиться, что, например, не перепутала пробирки. Сесилия проявила пленку в воскресенье, и действительно, при высокой концентрации соли РНК-компоненты фермента и у кишечной палочки, и у сенной снова проявляли активность, а их белковые компоненты не работали без РНК. Вот вам и «все ферменты – белки»! В то воскресенье Сид был у себя в кабинете, так что Сесилия смогла показать ему свои потрясающие результаты и поделиться восторгом от сделанного открытия.

Когда Сид пришел в лабораторию утром в понедельник, у него уже был написан черновик научной статьи, сообщающей об эксперименте. Они позвонили в лабораторию Нормана, чтобы поделиться результатом с коллегами. Норман был удивлен не меньше, в его картине мира так же прочно укоренилась аксиома «Все ферменты – белки»[90].

Открытие рибозимной природы РНКазы P, произошедшее через год после нашей статьи о РНК, способной к самостоятельному сплайсингу, внесло важное дополнение в концепцию рибозимов. В наших экспериментах мы обнаружили, что РНК может самостоятельно проводить собственный сплайсинг, то есть что она служит собственным внутренним катализатором. А группа Сида обнаружила, что РНК может служить и внешним катализатором, воздействуя на другую молекулу – предшественник тРНК. В обоих случаях РНК была активным двигателем клеточных реакций, а не молекулой, которая просто переносит информацию от ДНК. Именно поэтому всего через шесть лет, а именно в 1989 г., наши с Сидом взаимодополняющие исследования были удостоены Нобелевской премии по химии.

Наука работает загадочным образом. Вы предлагаете свои гипотезы, собираете доказательства, проводите эксперимент, проверяете полученные данные. Если вам повезет, то вы совершите открытие, которое ваши коллеги посчитают значимым вкладом в науку. Но вы не можете предсказать, что случится дальше, кто подхватит эстафету и куда все это будет развиваться. В случае с рибозимами новая каталитическая РНК была открыта в Австралии, скрытая в растительном патогене под названием «вироид солнечной пятнистости авокадо». Эти «молотоголовые»[91] рибозимы не забивали гвоздей, а катализировали очень простую реакцию: они разрезали себя или другие молекулы РНК в определенном месте. Из-за малого размера – около 30 нуклеотидов – они привлекли к себе много внимания[92]. Итак, РНК не обязательно должна быть огромной, чтобы действовать как фермент.

Вскоре ученые выяснили, что каталитическая сила РНК прячется и в мяРНК, отвечающих за сплайсинг. Оказалось, что природа прибегает к помощи мяРНК не только для такой важной задачи, как маркировка участков, где должен пройти сплайсинг. Кроме того, несколько мяРНК совместно катализируют реакции разрезания и соединения, составляющие сплайсинг. Многие исследователи, изучавшие разные биологические системы, внесли свой вклад в открытие этих функций мяРНК. Среди таких ученых была Кристин Гатри из Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе.

Кристин использовала в качестве исследуемой системы дрожжи, с помощью которых мы варим пиво. Поначалу это удивило многих ученых, занимающихся РНК. Однако дрожжи прекрасно подходят для генетических исследований: можно вызвать мутацию в определенном гене и посмотреть, что получится в результате, поэтому предполагалось, что эти исследования дадут представление о фундаментальных механизмах сплайсинга. По крайней мере, так думала Кристин в 1980 г. Она часто восхваляла «великолепную мощь генетики дрожжей». Если бы она смогла найти мяРНК дрожжей, соответствующие найденным у млекопитающих U1, U2, U4, U5 и U6 мяРНК и необходимые, как тогда считалось, для проведения сплайсинга мРНК, то, внося небольшие изменения в их последовательность, можно было бы изучить, связываются ли они с другими мяРНК или с мРНК. В случае удачи Кристин помогла бы раскрыть механизмы разрезания и соединения, благодаря которым происходит сплайсинг мРНК.

Хорошо, что у Кристин была столь сильная тяга к исследованиям, хотя она практически не получала никакой поддержки. Ее руководитель в аспирантуре прямо говорил: «Девушкам нечего делать в биохимии. Они не могут поднимать тяжелые роторы [часть центрифуги, которая удерживает пробирки] или проводить многие часы в холодной комнате [холодильное помещение, где проводят биохимическую очистку]»[93]. В то время как Кристин долгое время пыталась найти мяРНК дрожжей, что вполне очевидно, так как нельзя вызвать нужную мутацию, не зная, в каком гене она должна быть, многие ее коллеги, изучавшие РНК, отзывались о ее работе с пренебрежением. Они постоянно напоминали, что в дрожжах интроны есть лишь у крайне ограниченного количества генов, поэтому у них может быть уникальный механизм сплайсинга мРНК, не родственный тому, что мы наблюдаем у человека[94]. Если оглянуться назад, покажется странным, насколько некоторые биологи, погруженные в изучение эволюции, могли сомневаться в наличии фундаментальных механизмов сплайсинга, консервативных для всех тех видов, у которых есть интроны. Однако сложность обнаружения мяРНК у дрожжей подпитывала подобный скепсис. Может быть, у дрожжей и вовсе нет мяРНК?

Кристин и сотрудники ее лаборатории потратили пять долгих лет на тщательное изучение дрожжевых клеток, прежде чем нашли первую мяРНК под названием U5. С помощью ряда способов, применяемых генетиками при работе с дрожжами, удалось показать, что клетки, лишенные этой РНК, перестают расти и накапливают не прошедшие сплайсинг РНК. Это означало, что U5 дрожжей должна быть вовлечена в процесс сплайсинга[95]. К поиску присоединились новые группы исследователей, и вскоре были найдены и другие мяРНК[96], отвечающие за разные этапы реакции сплайсинга.

Теперь Кристин знала разных участников процесса сплайсинга, но оказалось, что они способны собираться вместе разными путями и что их положение может меняться в ходе реакции. Такую проблему не получится решить одним махом.

К 1986 г. был достигнут некоторый прогресс. Исследователи выяснили, что U1 связывается с левым концом каждого интрона, как изначально и предполагали Лернер и Стейц, но затем она уходит со сцены[97]. Рой Паркер, студент из лаборатории Кристин, показал, что рядом с правым концом каждого интрона прикрепляется U2[98]. Однако что происходило дальше, оставалось загадкой.

В то время я был в числе исследователей РНК, которые ежегодно собирались в Скалистых горах на лыжно-кулинарное мероприятие, прозванное Томом Стейцем «РибоСки». После дня, проведенного на склонах, Кристин, Джоан Стейц и Джон Абельсон часами обсуждали данные по сплайсингу, а я, Элсбет Лунд и Джим Дальберг из Висконсинского университета и Олке Уленбеком из Боулдера следили за их дискуссией. Всех нас интересовало, как мяРНК могут располагаться относительно друг друга на разных этапах реакции сплайсинга. Я уверен, что в такой дружеской атмосфере родилось немало хороших идей, но Кристин потребовалось еще несколько лет упорной работы, чтобы составить схему каждого этапа сплайсинга.

Прорыв случился в один из вечеров 1992 г. Кристин работала допоздна в своей лаборатории в Сан-Франциско, размышляя над новыми результатами, полученными вместе со студентом Хитеном Мадхани и касающимися мяРНК под названием U6[99]. На этот раз она нашла ключ к разгадке. Когда она набросала схему решения для механизма сплайсинга, то картина оказалась похожа не на обычную биохимическую реакцию, а на целое балетное представление. U6 выходит на сцену, тесно переплетаясь с U4, и вместе они находят свое место в интроне. Но тут в дело вмешивается U2, уводя U6, и U4 в ярости ретируется. После этого U6 и U2, отчасти при помощи U5, могут свободно выполнять химические реакции, необходимые для завершения сплайсинга. Вместе они действуют как рибозим, катализируя процесс сплайсинга мРНК.

Кристин была настолько потрясена обнаруженным феноменом, что просто обязана была кому-то об этом рассказать. Но в здании было почти темно. Выйдя в коридор, она встретила уборщика, который подметал пол, и поделилась с ним своим открытием.

«И он даже что-то понял!»[100]

Почему так много ученых, в том числе поначалу даже в моей лаборатории, или в лаборатории Сида Альтмана, или Нормана Пейса, не воспринимали всерьез предположение, что РНК может быть ферментом? Почему мы были так прочно привязаны к мысли, что в основе катализатора должен лежать именно белок? Отчасти потому, что мы знали, как белок сворачивается в сложные формы, предназначенные для выполнения конкретных и специальных задач. Разрушение этой структуры, например при нагревании белка или вследствие генетической мутации, ведет к потере такой активности.

И, напротив, о структуре РНК мы в то время знали недостаточно, чтобы понять, как она может быть катализатором. В частности, мРНК всегда изображают как отваренные спагетти: то есть неспособными принять какую-либо стабильную форму. Даже если спагетти в вашей тарелке и скручиваются, они сразу выпрямляются, когда вы цепляете их вилкой.

При работе с РНК мы думали о ней, так сказать, лишь в двух измерениях. Мы рассматривали линейный порядок оснований А, Г, Ц и У, подобно буквам в предложении, а также соединение оснований внутри этих последовательностей, как в структуре U1 мяРНК, описанной выше. Но чтобы понять, как РНК может быть ферментом, надо увидеть молекулу во всех трех измерениях. Вспомните, как мало мы понимали про молекулярные механизмы генетики, пока не увидели трехмерную форму двойной спирали ДНК. Точно так же мы не имели возможности понять каталитические молекулы РНК, пока не разобрались с их структурой.

В архитектуре есть знаменитый принцип: «Форма следует за функцией»[101], и это утверждение верно для многого другого в физическом мире. У молотка и отвертки разная форма, каждая соответствует своему назначению, но у них схожие рукоятки, потому что функция этой части одинакова – лежать в руке человека. Тот же принцип применим и на клеточном уровне. Если фермент расщепляет пищу на мелкие фрагменты, которые далее могут быть использованы в метаболизме, то у него будет углубление для размещения молекулы, например, крахмала, которую необходимо разрушить. Если функция белка – сокращение мышц, то у него должна быть подвижная область, которая будет обеспечивать растяжение и сокращение.

Взаимосвязь формы и функции означает, что мы не можем понять значение молекул жизни до тех пор, пока не узнаем их структуру, не выясним, из чего они сделаны и как соединяются друг с другом. Без знания структуры биологи похожи на механиков, пытающихся отремонтировать автомобильный двигатель в полной темноте. Это будет медленно, неэффективно и закончится разочарованием. Знание структуры подобно включению света. Теперь механики видят все детали двигателя, представляют, как они сочетаются друг с другом, какие части или соединения сломаны и как их можно починить. Первое поколение молекулярных биологов считало расшифровку физической структуры белков, а затем и ДНК важными и благородными задачами. Для этого применяли рентгеноструктурную кристаллографию. При использовании этого метода на образец, например на кристалл белка, направляют пучок рентгеновских лучей, получают изображение рассеянного излучения и рассчитывают, какая структура могла вызвать такое рассеивание. Представим себе камешек, брошенный в тихий пруд. От него идут круги, по которым можно определить место, где именно камешек попал в воду. Теперь представим, что в пруд бросили горсть камней. Картина получилась более сложной, но в ней содержится информация о месте падения каждого камешка. Точно так же картина рассеивания, созданная рентгеновским лучом, прошедшим через кристалл, помогает определить положение каждого отдельного атома белка.

А как насчет РНК? Мы уже знаем, что у РНК есть удивительные функции, и еще познакомимся со многими другими. Для каждой из этих функций должны существовать соответствующая форма и особая структура, обеспечивающие выполнение конкретной функции. Однако определить форму для РНК оказалось гораздо сложнее, чем для ДНК.

Джим Уотсон понял это далеко не сразу. После открытия двойной спирали он подумал, что на бис сможет разгадать и структуру РНК[102]. Но столкнулся с проблемой. У ДНК была только одна форма – двойная спираль, где две нити соединены друг с другом. Такая витая конструкция фиксирует обе нити и держит их под контролем, или, как мы, исследователи РНК, шутим, удерживает их от чего-нибудь интересного, например от катализа реакций. У РНК, напротив, нет одной-единственной формы, у нее миллионы возможных форм. Лишенная ограничений двойной спирали, РНК может принимать практически неограниченное количество форм, поэтому она потрясающе универсальна. При такой вариативности РНК еще важнее разобраться в многообразии ее перевоплощений. Однако определение структуры столь изворотливого вещества было сопряжено с немалыми трудностями.

Уотсон бился над проблемой РНК с десяток лет. Вначале он выделял РНК, в том числе из растительных вирусов, дрожжей и печени теленка, проводил эксперименты с дифракцией рентгеновских лучей и на основании весьма неточных данных пришел к выводу, что у разных РНК единая структура[103]. Это примерно как в густом тумане посмотреть на слона и на микроавтобус Volkswagen с расстояния 200 м и прийти к выводу, что они схожи по строению. Если бы у вас был бинокль и вы дождались ясной погоды, то ваш вывод был бы совершенно иным.

Прежде чем сдаться, Уотсон сделал шаг в верном направлении. Он перешел от изучения богатого набора разнообразных РНК с множеством функций и, соответственно, с множеством форм к работе с очищенными рибосомами[104], у РНК которых специфическая структура, подходящая для выполнения специфической функции – синтеза белка. Однако на разработку технологий и приемов, нужных для разгадки структуры рибосомы, науке потребовалось еще 40 лет.

И когда наконец перед нами предстали сложные структуры РНК, мы смогли непосредственно увидеть, как она творит свои чудеса, как служит машиной для сборки необходимых белковых молекул, достраивает концы хромосом или очень точно редактирует ДНК в клетках человека. Но все эти открытия каталитической силы РНК были в будущем. Успех начинался с малого.

Боб Холли из Корнеллского университета продолжил дело Джима Уотсона. В конце 1950-х гг. он понял, что глупо пытаться угадать единую структуру в смеси разных РНК, поэтому сосредоточился на транспортной РНК – адаптере, который соединяет аминокислоту и триплетный кодон. Транспортная РНК была небольшого размера, достаточного, чтобы у экспериментатора был шанс определить последовательность ее нуклеотидов, что в то время еще не было сделано ни для одного типа РНК[105].

Зачем Холли нужно было узнать последовательность РНК, прежде чем он или кто-либо еще попытается определить ее форму? Определение структуры РНК сродни составлению схемы предложения. Даже если вы величайший в мире специалист по грамматике, вы не составите схему предложения, пока не сможете прочитать его. Последовательность нуклеотидов дает вам последовательность букв в вашем предложении – азотистых оснований А, У, Ц и Г. Как только вы увидите их порядок, вы сможете приступить к составлению схемы предложения, определяя, как элементы расположены в пространстве и как они взаимодействуют друг с другом.

В качестве источника тРНК Холли выбрал всё те же дрожжи – организмы, которые мы используем в хлебопечении и пивоварении. Он знал, что в клетках дрожжей содержится много тРНК, и мог купить в местной пекарне столько дрожжей, сколько нужно. Впрочем, чтобы за три года работы получить в общей сложности 1 грамм (масса одной изюминки) тРНК определенного вида, Холли понадобилось примерно 140 килограммов дрожжей[106].

Холли удалось очистить тРНК, которая была адаптером для аминокислоты аланина[107]. Как только он и его команда получили очищенную тРНК, ее начали резать на фрагменты, достаточно короткие для химического анализа, а затем определять порядок этих фрагментов. Уже через год у них была расшифрованная последовательность нуклеотидов, что позволило впервые определить структуру РНК.

В 1965 г. Элизабет Келлер, опытная исследовательница из группы Боба Холли, взялась выяснить, как тРНК, переносящая аланин, складывается в двух измерениях. Последовательность оснований была известна, но предстояло понять, как они могут взаимодействовать между собой.

Вспомните, что РНК обычно состоит из одной нити. В ДНК основания одной нити попарно соединяются с основаниями другой нити, образуя ступеньки ДНК-лестницы и двойную спираль независимо от последовательности нуклеотидов. Но в РНК последовательность определяет форму: основания из одного участка молекулы могут находить себе пару совсем в другом участке. Связь одной пары Ц-Г слишком слабая, чтобы удерживать части вместе, тем не менее если, например, у вас четыре последовательно расположенных Г, которые связываются с четырьмя Ц, то такая структура из четырех пар оснований уже держится стабильно. Это спаривание оснований, зависящее от последовательности РНК, заставляет молекулу сворачиваться, формируя «шпильки», ветви, петли, узлы и множество других возможных фигур. Келлер быстро обнаружила, что в сворачивании тРНК могут участвовать разные комбинации пар оснований. Какая из них правильная?

Одна из подсказок заключалась в трех основаниях тРНК, которые связываются с кодоном мРНК. Поскольку они комплементарны кодону, этот триплет получил название «антикодон». Келлер и Холли сочли логичным предположение, что антикодон должен не прятаться где-то внутри складок молекулы, а торчать наружу, чтобы легко связываться с мРНК[108].

Моделируя разные варианты спариваний оснований, Келлер использовала ершики для чистки курительных трубок и кусочки застежки-липучки. В итоге она описала характерную форму трилистника, которая наиболее соответствовала ожиданиям: на вершине центрального листочка структуры располагался непарный антикодон, готовый соединиться с соответствующим кодоном мРНК.

В одноцепочечной РНК пары оснований могут образовывать внутри молекулы разные фигуры, например изображенную на рисунке «шпильку», или «стебель-петлю». Внизу слева показано, какие основания соединяются, а внизу справа изображена трехмерная форма этой «шпильки»

Вскоре были определены последовательности десятка других тРНК[109], и каждая из них теоретически могла принимать форму клеверного листа. С учетом того, что всем тРНК необходимо помещаться в одних и тех же участках в рибосоме, чтобы доставлять аминокислоты А к месту синтеза белка, ясно, что такие курьеры должны иметь одинаковую форму. Поскольку была найдена «форма, подходящая всем», это подтверждало, что структура в виде клеверного листа определена верно.

Это, несомненно, был значительный прорыв, хотя в модели клеверного листа Келлер имелось одно существенное упрощение. Она лежала на плоском столе, изображая двухмерную тРНК. Я иногда называю такие двухмерные схемы «раздавленными на дороге», потому что они показывают, как выглядела бы РНК, если бы ее переехал грузовик. Судить о поведении РНК по ее двухмерной модели так же сложно, как судить о поведении белки по ее расплющенному тельцу.

За счет соединения оснований тРНК принимает форму клеверного листа (слева), который потом сворачивается в трехмерную L-образную структуру (справа). Триплетный антикодон доступен, что позволяет ему образовывать связи с кодоном РНК мРНК и доставлять правильную аминокислоту (Ак) в рибосому

В конце 1960-х гг. развернулась гонка за определение трехмерной структуры тРНК. Соревновались Кембридж против Кембриджа: одну команду возглавляли Ким Сон Хоу и Алекс Рич из Массачусетского технологического института, другую – Аарон Клуг и Дж. Д. Робертус из лаборатории молекулярной биологии в другом Кембридже[110].

Они выбрали метод рентгеноструктурной кристаллографии, с помощью которого в то время повсеместно определяли структуру белков. Для выращивания кристаллов в лаборатории готовят сильно концентрированный раствор очищенных молекул, а затем их размещают в ряде капель с различными концентрациями добавок, например солей. Надо найти золотую середину, когда образуются подходящие кристаллы. Если молекулы слишком хорошо растворяются в капле, раствор останется прозрачным и в нем не будет никаких кристаллов. Если же молекулы окажутся нерастворимыми, то они выпадут в виде бесполезного мутного осадка. В какой-то капле возникнут условия, при которых ваше вещество будет балансировать на грани растворимой и нерастворимой формы, и тогда его молекулы начнут прижиматься друг к другу, образуя правильные ряды и столбцы. Наблюдая за ними в микроскоп, вы увидите красивые кристаллы с острыми гранями. Эти кристаллы будут медленно расти и с каждым днем становиться все крупнее. Затем один такой кристалл размещают напротив пучка рентгеновских лучей, включают излучение и собирают изображения, рассеянные кристаллами. После нескольких дополнительных действий и множества расчетов структура может быть «вычислена», то есть вы получите трехмерную модель, где указан каждый атом.

Кристаллизация наполовину наука, наполовину искусство, поэтому ученые понимали, что работать надо с тем, с чем получается. Среди тРНК проще всего образовывались кристаллы той, что переносит фенилаланин, вот почему именно ее структуру расшифровали и та и другая команда-конкурент. Оказалось, что форма листа клевера, предсказанная Элизабет Келлер, была верной и этот листок сам собой сворачивался в молекулу L-образной формы[111]. На одном конце L был антикодоновый триплет, а на другом крепилась соответствующая ему аминокислота фенилаланин.

Итак, в 1974 г. впервые была определена трехмерная структура РНК с известной биологической функцией, и это стало потрясающим достижением команд из обоих Кембриджей. В подобных случаях за первым открытием обычно идут быстрой чередой множество других. Это как первая упавшая косточка домино, которая вызывает каскад падений. Но такой эффект не соответствовал истории РНК. За 15 лет после открытия структуры тРНК фенилаланина ни для каких других молекул РНК, более длинных, чем тРНК, структура не была расшифрована. Несмотря на огромные усилия бесчисленного множества ученых, другие известные типы РНК оказались слишком изворотливыми, так что их структуру зафиксировать не удавалось. А в отсутствие структуры, на которую можно было бы ориентироваться, изучение роли отдельных нуклеотидов в крупных молекулах РНК, таких как рибозим тетрахимены, происходило крайне медленно и с большим трудом.

Пока все ожидали появления технологии, позволяющей хорошо кристаллизовать более сложные по типу РНК, Франсуа Мишель размышлял. Франсуа был сотрудником Национального центра научных исследований (НЦНИ) в городе Жиф-сюр-Иветт недалеко от Парижа. Он увлекался коллекционированием, разведением и выяснением генетических особенностей разных видов бабочек и с такой же страстью собирал последовательности РНК. У него была на них поразительная память. Говорят, что он мог сравнивать в уме молекулы и пытался их соединить друг с другом разными способами, даже когда спал. Он был похож на эксцентричного гения – пышная шевелюра, большая борода. Когда я встречал его на конференциях, мне иногда казалось, что он только что вышел из леса после многомесячной охоты за бабочками.

Коллеги Франсуа из Жифа обнаружили в ДНК дрожжевых митохондрий – структурах, выполняющих роль энергетических станций клеток, – новую группу интронов с удивительными генетическими свойствами. По девяти различным интронам были разбросаны маленькие и практически идентичные фрагменты. Причем эти фрагменты располагались в одном и том же порядке, что указывало на выполнение ими схожих функций. Франсуа знал, что эти короткие последовательности нуклеотидов жизненно необходимы для сплайсинга, потому что если в них случались мутации, то сплайсинг не происходил. Более того, пары этих фрагментов были комплементарны друг другу, и логично было сделать вывод, что они могут сцепляться друг с другом, образуя «шпильку» (см. рисунок выше). В 1982 г. Франсуа предположил, что эти парные участки РНК способны образовывать схожие двухмерные структуры для всех таких митохондриальных интронов у дрожжей[112].

Но зачем интронам нужна какая-то особая форма? Ведь если они похожи на интроны мРНК, открытые Филом Шарпом и Ричардом Робертсом, то им не надо обладать определенной структурой, чтобы они могли связываться с мяРНК U1 и U2. Загадка структуры интронов продержалась недолго, потому что вскоре после того, как Франсуа предложил свою модель, мы опубликовали нашу статью об открытии рибозима у тетрахимены. Франсуа потребовалось несколько секунд, чтобы посмотреть на последовательность нуклеотидов в интроне тетрахимены и понять, что его двухмерная модель подходит и для нашего самовырезающегося интрона[113]. Это было удивительно и неожиданно. Дрожжи эволюционно очень далеки от инфузорий, к которым относится тетрахимена, а митохондриальные гены совсем не похожи на ядерные. Так почему же неродственные во всех отношениях РНК принимали сходную форму? Ответ был шокирующим. Такая форма должна была быть необходимой для катализа реакции самостоятельного сплайсинга, а это значит, что и митохондриальные интроны у дрожжей должны быть способны к самостоятельному сплайсингу. И действительно, в 1985 г. группа голландских ученых подтвердила это предположение[114].

Двухмерная модель Франсуа выглядела как расширенная версия клеверного листа тРНК. Интроны РНК были в несколько раз длиннее, чем тРНК, а их структура была более сложной. Вместо четырех «шпилек», имевшихся в тРНК, там присутствовало более десятка подобных форм. Появление такого подробного плана молекулы было заметным достижением, но Франсуа понимал, что каталитическая функция РНК реализуется не в двухмерном пространстве. Он стремился построить трехмерную модель, основываясь только на последовательности нуклеотидов, чего еще никто не делал для таких больших РНК.

В 1983 г. на научной конференции Франсуа познакомился с Эриком Вестхофом из Страсбургского университета. Эрик провел детство в Бельгийском Конго, получил диплом физика в Льежском университете и затем изучал структуру тРНК с помощью рентгеноструктурной кристаллографии в Висконсинском университете. Со своим образованием и навыками он прекрасно дополнял Франсуа, и оба страстно мечтали получить из двухмерной модели РНК трехмерную. Страсбург расположен в богатой виноградниками долине Рейна, а это не очень близко от Парижа, так что Франсуа, приезжая к Эрику для обсуждения модели, брал с собой спальный мешок. Эрик сидел за компьютером, строя спирали РНК, соответствующие парным участкам в структуре интрона тетрахимены. Это было несложно: участки двойной спирали РНК похожи на маленькие фрагменты двойной спирали ДНК, а углы наклона спирали соответствовали тому, что можно было видеть у кристаллической структуры тРНК. Значительно сложнее было выяснить, как надо расположить эти маленькие спирали в трехмерном пространстве, чтобы получить структуру фермента. Оставалось надеяться, что их трехмерное расположение удастся понять по участкам РНК, соединяющим спирали, ведь именно такие промежуточные последовательности обеспечивают сворачивание клеверного листа тРНК в L-образную трехмерную форму.

Франсуа сидел рядом с Эриком и просматривал распечатки 87 последовательностей сходных интронов, способных к самосплайсингу. Помимо распечатанных последовательностей, множество других Франсуа держал в уме. Когда Эрик на своем экране перемещал участки РНК, образуя новые фигуры, Франсуа искал любые согласованные изменения в последовательностях различных интронов, которые указывали бы на то, что определенные нуклеотиды граничат друг с другом в трехмерном пространстве. Как только Франсуа находил такие участки, раздавалось его восклицание: «Вот оно!» По ночам он сворачивался калачиком в спальном мешке рядом с компьютером Эрика, а видения последовательностей РНК кружились в его голове, как бабочки в танце[115].

К 1990 г. Франсуа и Эрик создали свою трехмерную модель интрона тетрахимены[116], и, с точки зрения специалистов по РНК, она была потрясающе красива. Она (модель) больше всего напоминали родителей, обнимающих своего ребенка. «Ребенком» были двуцепочечные участки РНК в местах, где должно произойти разрезание и последующее соединение. Одним из «родителей» был участок РНК, который, как ранее показал Франсуа, содержал гаунозин. Он выступал в роли ножниц, которые «вырезали» интрон[117]. Другим «родителем» служил P4–P6 (спаренные области 4–6), помогая правильно расположить эти ключевые элементы РНК.

В такую модель все идеально укладывалось, но насколько она соответствовала реальной структуре? Чтобы это выяснить, потребовалась рентгеноструктурная кристаллография, а также талант и сила духа молодой женщины с Гавайев.

Трехмерная структура РНК тетрахимены, способной к самосплайсингу, смоделированная Франсуа Мишелем и Эриком Вестхофом. Интрон (светло-серый) соединен с РНК рядом с сайтом сплайсинга (темно-серый). Интрон также связан с молекулой гуанозина (Г). Гуанозин сам по себе является одним из структурных элементов РНК. Здесь он используется как химические ножницы, разрезающие РНК, отмеченную темным цветом, в месте сплайсинга

Дженнифер Даудна выросла на зеленом восточном побережье Большого острова Гавайев. С ранних лет она увлекалась наукой, исследуя чудеса местных литоральных водоемов и с трепетом поднимаясь на край действующего вулкана Килауэа[118]. Ради продолжения учебы она пересекла Тихий океан, поступила на специальность «биохимия» в Помонский колледж в Калифорнии, а затем двинулась дальше и стала аспиранткой Гарвардской медицинской школы. Там она защитила диссертацию по функциям рибозима тетрахимены.

Таким образом, мы с ней оказались в некоторой степени конкурентами, хотя наше соперничество было исключительно дружеским. Когда в период своей аспирантуры Дженнифер приехала ко мне в Боулдер, эта хрупкая женщина произвела на меня большое впечатление и, возможно, даже немного меня напугала. Она могла великолепно спланировать эксперимент для проверки любой гипотезы и обладала такой энергией и драйвом, каких я не встречал больше ни у одного ученого. Поэтому, когда в 1989 г. она защитила диссертацию и попросилась к нам в постдокторантуру, я сразу же согласился.

Мы с Дженнифер, как и многие другие специалисты по РНК, были убеждены, что для понимания механизмов работы всякого рибозима необходимо получить трехмерное изображение его формы. Но в исследованиях РНК наблюдался застой: с тех пор как полтора десятилетия назад была описана форма транспортной РНК, структуры каких-либо более крупных РНК открыты не были. Мы понимали, что получение такого изображения было очень перспективной задачей. И если бы нам удалось решить ее, это стало бы достижением, которое вошло бы в учебники по всему миру.

Разгадав структуру рибозима, мы бы открыли поистине золотую жилу для получения ответов на более общие вопросы о структуре РНК, в том числе помогли бы разгадать пресловутую головоломку, каким образом РНК сворачивается, принимая специфическую для катализатора форму. Способы сворачивания белков и формирования каталитически активных центров были хорошо известны. Белковый фермент убирает все свои гидрофобные (боящиеся воды) боковые цепочки внутрь, образуя гидрофобное ядро. Это позволяет сформировать каталитически активную бороздку на внешней гидрофильной (любящей воду) поверхности. Но РНК не может сворачиваться таким же образом, поскольку у нее нет никаких гидрофобных участков, которые можно было бы для этого использовать. Более того, РНК на всем своем протяжении заряжена отрицательно, тогда как боковые цепи белка, как правило, не имеют заряда[119]. Чтобы РНК образовала компактную структуру, все эти отрицательные заряды должны оказаться рядом друг с другом. Это все равно что расположить магниты южными полюсами внутрь и попытаться их сблизить – они будут отталкиваться. Форма тРНК была лишь одним примером возможной структуры РНК, и она не была катализатором. Сама по себе тРНК ничего не делает без рибосом и мРНК. Структура рибозима тетрахимены дала бы первые представления о том, как крупная молекула РНК может складываться наподобие белка, хотя кажется, что она для такого действия не приспособлена.

Когда в 1991 г. Дженнифер приехала к нам в Боулдер, мы с ней решили, что было бы слишком самонадеянно пытаться сразу определить структуру рибозима тетрахимены, который состоял из 414 нуклеотидов, то есть был примерно в шесть раз длиннее тРНК. Вместо этого мы выбрали в качестве первой цели для кристаллографии половину этой молекулы. Причем половину с такой структурой и функцией, что она была достойна усилий. Аспирантка из моей лаборатории Фелисия Мерфи выделила подходящий нам ключевой компонент рибозима – P4–P6[120]. Фелисия обнаружила, что он сам складывается поперек, напоминая старомодную бельевую прищепку, и что он важен для правильной ориентации нити РНК, содержащей один или два сайта сплайсинга, хотя на уровне отдельных атомов детали были еще неизвестны. Дженнифер предстояло их выяснить.

Дженнифер объединилась с научным сотрудником нашей лаборатории Анной Гудинг, и вместе они синтезировали участок РНК P4–P6 и приготовили набор капель с разными солевыми условиями для кристаллизации. Вскоре был найден вариант, при котором образовывались красивые кристаллы с острыми гранями. Предположительно, молекулы РНК были выстроены в этих кристаллах идеальными рядами и колоннами, однако поначалу рентгеновский луч не давал хорошей дифракционной картины. Само излучение повреждало РНК в кристалле, мешая получить четкое изображение.

В 1993 г. в Боулдере проводили свой творческий отпуск два профессора из Йельского университета, а именно супруги Стейц, Джоан и Том, постоянные участники РибоСки. Они встретились с нашей научной группой и с группой моего коллеги Олке Уленбека. Том Стейц был одним из крупнейших в мире специалистов по рентгеноструктурной кристаллографии, и его команда в Йельском университете определила устройство некоторых важных структур, в том числе ключевых комплексов ДНК и РНК с белками. Том любил поговорить на профессиональные темы в нашей комнате отдыха и однажды в беседе с Дженнифер упомянул, как его группа начала замораживать кристаллы, чтобы свести к минимуму повреждения от радиоактивного излучения. Они использовали жидкий азот, чтобы сохранить пропанол очень холодным, а затем быстро погружали в пропанол кристалл – так, чтобы не успел образоваться лед. Дженнифер и Анна применили этот метод и с радостью обнаружили, что дифракционная картина участка P4–P6 заметно улучшилась. Этого оказалось достаточно, чтобы можно было увидеть, как расположены отдельные атомы в свернутой структуре РНК.

Однако, как правило, научный прогресс – это два шага вперед и шаг назад, и так бывает еще в удачную неделю. Нашим большим «шагом назад» была техническая проблема[121], которая постоянно беспокоила нас с Дженнифер во время ее работы в Боулдере. Для определения структуры нужны кристаллы не только самой молекулы, но и ее тяжелоатомного производного, где в одной или в нескольких фиксированных позициях в молекуле находится тяжелый атом.

Под тяжелым атомом подразумевается элемент, у которого много протонов, нейтронов и электронов, например платина, золото, серебро, ртуть, селен, вольфрам или осмий. Только сравнивая дифракционную картину обычного вещества и его тяжелоатомного производного, можно рассчитать трехмерную структуру молекулы. Тяжелые атомы, которые могли угнездиться в выемках белковых молекул, были хорошо известны, но РНК – это совсем другое. Те тяжелые атомы, которые использовались с белками, просто не подходили для РНК.

Итак, на тот момент структура P4–P6 оставалась неразгаданной. Однако после трех лет работы у Дженнифер благодаря ее диссертации в Гарварде и успешным новаторским исследованиям структуры РНК в Боулдере была такая блестящая репутация, что университеты боролись за право пригласить ее на работу. Она выбрала Йельский университет – во многом потому, что у нее уже были хорошие отношения с Томом и Джоан Стейц. И захватила с собой аспиранта из Боулдера Джейми Кейта, который продолжал проверять металл за металлом, надеясь получить тяжелоатомное производное. После того как многие металлы не подошли для этой задачи, Джейми заметил, что ион осмия по размеру как раз такой, что его можно использовать для замещения иона магния в свернутой РНК. Подходящее соединение осмия было синтезировано химиком из Стэнфордского университета, который вот-вот уходил на пенсию. По счастливой случайности Джейми связался с ним перед самой ликвидацией его лаборатории и получил в подарок то, что оказалось волшебным металлом. Это соединение осмия действительно заменило три атома магния, связанные с определенными участками РНК[122], что в 1996 г. привело наконец Дженнифер и Джейми к разгадке структуры P4–P6 РНК.

Картина открылась великолепная. Стало понятно, как молекула может складываться, подобно белкам, образуя компактное внутреннее ядро, что казалось столь сложным для РНК. Впрочем, для РНК-катализатора это было логично – сворачиваться как белок. Ведь если РНК ведет себя как белок, то почему бы ей и не выглядеть как белок? Оказалось также, что внутри у нее располагаются положительно заряженные ионы магния, которые обычно входят в состав живых клеток, и это решает проблему отталкивания отрицательно заряженных участков РНК при ее сворачивании. Давайте еще раз вспомним магниты: если вы захотите сблизить два отрицательно заряженных полюса так, чтобы они оставались рядом друг с другом, то разместите положительный полюс между ними.

Дальше надо было определить структуру целого рибозима. Барбара Голден приехала в Боулдер проходить постдокторантуру, и в 1998 г. она установила новый рекорд в РНК-кристаллографии, исследуя участок интрона тетрахимены длиной в 247 нуклеотидов, у которого была каталитическая активность[123]. В эту РНК входил и домен P4–P6, который, как мы и предсказывали, в составе активного рибозима P4–P6 выглядел почти так же, как и сам по себе. Кроме того, у интрона Барбары существовала «колыбель», образованная цепочкой РНК, которая должна была охватить спираль РНК в месте проведения сплайсинга. Это было вполне похоже на модель, которую предложили Мишель и Вестхоф восемью годами раньше.

Открытие структуры домена P4–P6 тетрахимены послужило стимулом к развитию небольшой научной области, занимающейся структурой РНК, и вскоре было описано строение других крупных функциональных молекул РНК[124]. В совокупности эти результаты позволяли хотя бы предварительно оценить многочисленные возможности РНК. У каждой ее разновидности, безусловно, была своя форма, но общие принципы, которые мы отметили у тетрахимены, вероятно, вновь повторялись во многих других РНК. Это прекрасно демонстрировало, насколько сложны могут быть молекулярные машины, составленные только из А, Г, Ц и У.

Следующее десятилетие изучение структуры РНК продолжалось примерно теми же темпами. Каждый год специалисты описывали еще одну или две новые конфигурации. Исследователи постепенно продвигались вперед; однако, в то время как были разгаданы уже десятки тысяч белковых структур, у РНК доля известных структур составляла менее одного процента[125]. Ситуация не могла не огорчать, поскольку тормозилось выявление фундаментальных основ устройства РНК и развитие жизненно важных по своему потенциалу медицинских технологий. Ученым, разрабатывающим препараты для борьбы с заболеваниями, необходимо подробно знать строение своих молекул-мишеней, чтобы не действовать вслепую. Если мишень – белок, то ее структура обычно уже бывает кем-то определена или же ее можно рассчитать на основе обширных баз близкородственных веществ. Но структуры многих РНК оставались неизвестны, что сдерживало разработку препаратов. Для эффективного определения структуры молекул РНК нужен был новый подход.

Кроме медленной и неточной рентгеноструктурной кристаллографии, есть и другие способы предсказать форму молекулы РНК. Один из методов мы знаем: надо найти по-настоящему умных людей, хорошо понимающих принципы сворачивания РНК, таких как Франсуа Мишель и Эрик Вестхоф, и дать им несколько лет на решение проблемы. Но можно подойти и с другой стороны: взять тысячи обычных людей, незнакомых со структурой РНК, и позволить им в течение нескольких часов попытать силы в решении задачи. Все мы слышали про краудсорсинг. Может ли он сработать в отношении такой непростой темы, как сворачивание РНК? И скольких людей можно этим заинтересовать?

В один январский день 2017 г. я сидел в кабинете Риджу Даса в Стэнфордском университете с открытым от изумления ртом. Всегда интересно послушать рассказ коллеги о том, как он сделал что-то фантастическое, о чем ты даже помыслить не мог. Риджу тогда привлек 37 000 человек со всего мира к компьютерной игре Eterna, или EteRNA, и эти игроки искали способы сворачивания РНК[126].

В 2009 г. в игре ЕteRNA появилась первая задача – спроектировать такую РНК, которая будет сворачиваться в виде пятиконечной звезды или в виде креста. То есть надо было определить, какая последовательность А, Г, Ц и У станет образовывать правильные пары, которые сложатся в заданную форму. В игре участвовали самые разные люди. Там были как аспиранты, занимавшиеся исследованиями РНК, так и любители разгадывать судоку, которые едва ли слышали про РНК, но хотели попробовать решить новый вид головоломок. Одни игроки разработали компьютерные программы для сворачивания РНК, другие обходились карандашом и бумагой. Участники выкладывали свои решения на сайт ЕteRNA, а затем все голосовали за те последовательности, которые, по их мнению, вероятнее всего примут только нужную форму и никакую другую. Восемь последовательностей, получившие наибольшее число голосов, были синтезированы в Стэнфордском университете. Каждая из них была проверена с помощью надежного метода SHAPE, предложенного моим бывшим постдоком Кевином Уиксом, ныне работающим в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилле. При использовании этого метода РНК обрабатывают специальными веществами, взаимодействующими только с одиночными нуклеотидами, а затем определяют прореагировавшие нуклеотиды. Например, если РНК действительно свернулась в виде звезды, то SHAPE должен выявить прореагировавшие нуклеотиды, как показано на рисунке ниже.

Победители конкурса ЕteRNA на предсказание последовательности РНК, сворачивающейся в виде креста, вытянутого креста или звезды. Чтобы проверить точность предсказания, провели химическую реакцию по методике SHAPE, которая выявила одноцепочечные участки в каждой структуре. Некоторые из них показаны стрелками

В этом испытании приняли участие 37 000 игроков, и лучшие из них нашли решения для всех задач. Результаты оказались настолько впечатляющими, что были опубликованы, причем в качестве соавторов, что еще удивительнее, указали 100 участников ЕteRNA[127]. По состоянию на 2022 год этим сообществом игроков были решены 4 181 632 задачи по определению структур РНК, причем большинство участников практически ничего не знали о РНК до того, как увлеклись игрой.

В последние годы ЕteRNA подняла ставки и занялась настоящими исследовательскими проектами. Например, в конкурсе Open Vaccine 2020 г. игроки должны были разработать улучшенную версию мРНК-вакцины против COVID–19, для хранения которой не требовались бы сверхнизкие температуры. Гипотеза (а точнее, обоснованное предположение) заключалась в том, что, если разработать мРНК, кодирующую белок шипа коронавируса, в которой будет множество спаренных оснований, такая молекула будет более стабильной при хранении и при введении в руку человека. А поскольку многие аминокислоты кодируются двумя, четырьмя и даже шестью кодонами, то количество возможных вариантов записи белка шипа было просто невероятным. Это число – 10⁶³⁰ – казалось бесконечным, и не существовало компьютера, способного обработать такое количество последовательностей. Поэтому ЕteRNA пригласила к решению проблемы всех желающих и стала ждать поступления ответов. Кандидатов было много, потому что этот конкурс начался 18 марта 2020 г., когда многие люди оказались из-за COVID–19 заперты в своих домах.

Игроки нашли множество вариантов «суперсвернутых» РНК, где большинство оснований были соединены попарно. Однако действительно ли эти последовательности были более стабильными? В Стэнфордском университете протестировали стабильность восьми таких «суперсвернутых» РНК при хранении и введении внутрь человеческой клетки. Ко всеобщей радости, эти последовательности действительно оказались более устойчивыми, чем те, что были разработаны современными компьютерными программами[128]. И тогда стэнфордские исследователи затаили дыхание[129]: вдруг эти молекулы РНК настолько плотно упакованы, что не смогут пройти через рибосомы и белок шипа не образуется? Беспокойство оказалось напрасным, трансляция с мРНК в белок прошла без проблем. Тогда наконец «суперсвернутую» мРНК передали в Pfizer разработчикам, которые проверили, как долго она сохраняется в форме вакцины. После хранения при умеренно высоких температурах в течение двух недель эта вакцина практически не изменилась, сохранившись намного лучше, чем вакцины, разработанные с помощью современных технологий. Существующие официально одобренные мРНК-вакцины против COVID–19 хранятся и перевозятся при сверхнизких температурах, а это затрудняет их доставку в бедные страны, поэтому повышенная термостабильность дает замечательные возможности в дальнейшем получить более доступный и дешевый препарат для прививок.

Использование коллективного разума – уникальный способ определить структуру РНК. Однако в будущем в этой области, вероятнее всего, произойдет замена человеческого разума на машинное обучение. Искусственный интеллект (ИИ) уже пишет статьи для газет и посты в социальные сети, он может превращать речь в текстовую версию, он способен, впрочем, пока только теоретически, обеспечить безопасное движение беспилотных автомобилей по городу. Так можем ли мы использовать его для предсказания структуры РНК? Мог ли он сэкономить Мишелю и Вестхофу семь лет работы, потребовавшиеся для разгадывания структуры интрона, способного к самостоятельному сплайсингу? Мог ли он сберечь семь лет работы моей лаборатории, в течение которых мы определяли структуру этого интрона с помощью рентгеноструктурной кристаллографии? Мог ли он заменить 37 000 человек, играющих в EteRNA, чтобы найти лучшие последовательности, позволяющие РНК свернуться в виде креста или звезды? Почти наверняка ответ будет «Да», и, хотя мы этого еще не достигли, будущее кажется очевидным.

В 2021 г. один из авторов игры EteRNA Риджу Дас и его коллега по Стэнфордскому университету Рон Дрор объявили о крупном достижении[130]. Им удалось разработать программу ИИ, которая может довольно точно предсказывать, какую трехмерную форму примет заданная последовательность РНК при сворачивании. Среди сложностей, с которыми они столкнулись, был подбор адекватного «набора данных для обучения». Алгоритмам ИИ необходимо обучение на некой известной информации, прежде чем погрузиться в неизвестность. ИИ без проблем отличает фотографии собак от фотографий кошек, потому что эта программа обучилась на миллионах изображений в интернете, подписанных как «Собака» или «Кошка». Но в случае РНК у Даса и Дрора в наборе для обучения имелось лишь 18 последовательностей, структура которых была известна. Более того, они просили ИИ не просто распознать увиденную форму РНК, а в соответствии с последовательностью А, Г, Ц и У предсказать правильную трехмерную структуру. Примечательно, что заданных 18 последовательностей оказалось достаточно, чтобы их программа превзошла предыдущие методы предсказания структуры РНК.

Как можно оценить успешность предсказания трехмерной структуры РНК? Эрик Вестхоф привлек со всего мира специалистов по изучению структуры РНК к игре, которую он назвал «РНК-пазл»[131]. Когда кто-либо из участников расшифровывал строение очередной РНК, например с помощью кристаллографии, он соглашался задержать публикацию решения, чтобы у других игроков оставался месяц на выработку своего предложения на основе одной лишь последовательности. Проще говоря, игроки не знали уже полученного кем-то ответа. Одни для предсказания структуры разрабатывали автоматические веб-серверы, другие делали это вручную. Все решения собирались, и, когда заканчивался срок сдачи вариантов, раскрывалась истинная структура РНК.

Для всех четырех предложенных РНК-пазлов метод ИИ Даса и Дрора дал самую точную из предложенных версий. Этот алгоритм еще не совершенен, но он уже близок к тому, чтобы стать надежным инструментом для сообщества исследователей. Насколько можно судить, в будущем подобные структуры будут определяться без лабораторных экспериментов и расчетов – отличная перспектива для научного прогресса, но немного грустно для тех из нас, кто годами занимался стряпней по молекулярным рецептам и затем смаковал результат.

Получение трехмерного изображения тРНК, а затем и рибозимов сильно повлияло на изучение РНК. Ученые смогли увидеть, как тРНК складывается, чтобы потом разместиться в рибосоме, доставив туда нужную аминокислоту и расположив ее так, чтобы соседние аминокислоты могли прореагировать в процессе образования пептидной цепочки. Ученым удалось понять на уровне отдельных атомов, как рибозим тетрахимены располагает гуанозин для атаки на сайт сплайсинга РНК, как РНКаза P катализирует разрушение определенных связей, чтобы получить зрелую тРНК, и как мяРНК организуют сплайсинг мРНК. Мы не только пытаемся разобраться, как устроена природа; знание структуры РНК позволяет ученым и биоинженерам создать рибозимы, которые в составе молекулярных систем могут выявлять токсичные вещества или определенные вирусы в пробах, взятых из окружающей среды. Есть целая область в синтетической биологии, где рибозимы используются в качестве сенсоров и переключателей, и для этого вначале надо было узнать строение РНК.

Успешное определение трехмерной структуры все более крупных молекул РНК вдохновляло исследователей в этой области на новые свершения. Несколько бесстрашных ученых нацелились даже на последний оплот клетки, главную молекулярную машину, устройство которой долгое время было покрыто тайной. Они решили разгадать структуру рибосомы.

Гарри Ноллер не похож на большинство других биохимиков. Слова «крутой» и «биохимик» редко встречаются в одном предложении, но Гарри действительно крутой. Он одновременно профессор Калифорнийского университета в Санта-Крузе и джазовый музыкант, игравший на саксофоне с Четом Бейкером. В свободное время он занимается модернизацией винтажных Ferrari. А еще он прирожденный полиглот. Я бывал вместе с ним на зарубежных конференциях, и, где бы мы ни оказывались, он, сев за столик в кафе, всегда, кажется, мог сделать заказ на местном языке.

Калифорнийский университет в Санта-Крузе расположен в изумительном месте, среди высоченных секвой на северном берегу залива Монтерей. Когда в 1968 г. Гарри организовал здесь свою исследовательскую лабораторию, его целью было понять, как работает рибосома. Эта мощная молекулярная машина, производящая все белки во всех живых организмах, – настоящее чудо природы. Подобно паровозу, идущему по железнодорожным путям, рибосома движется вдоль матричной РНК. Она останавливается на мгновение у каждого триплетного кодона, ожидает, пока к нему присоединится подходящая транспортная РНК, и добавляет соответствующую аминокислоту к растущей белковой цепи. Рибосома потрясающе универсальна: дайте ей тысячу разных мРНК, и она образует тысячу соответствующих белков.

Когда Гарри начал свои исследования, все еще думали, что белки – единственные вещества в природе, способные катализировать биологические реакции; поэтому Гарри поставил себе задачу выяснить, какие именно белки в рибосоме выполняют эту нелегкую работу по синтезу белка[132]. Предположительно, один рибосомный белок мог связываться с мРНК, один или два могли связываться с тРНК и один мог катализировать перенос пептидной группы (транспептидазная реакция – так ученые назвали химический процесс, при котором две аминокислоты соединялись вместе).

Не имело значения, что рибосома по массе лишь на треть состоит из белка, а на две трети – из рибосомной РНК. В рибосомах у бактерий, в том числе у E. Coli – кишечной палочки, с которой работал Гарри, таких РНК было три. Ученые предполагали, что эти РНК служат своеобразными строительными лесами, помогая организовываться белкам, выполняющим ключевые функции[133]. Иначе говоря, белок был королем, а рибосомные РНК всего лишь невежественными простолюдинами, прислуживающими королю.

Однако с планом «Найти белки, выполняющие ключевые функции» что-то пошло не так. Гарри создал систему, позволявшую собирать рибосомы из составных частей – РНК и белков – и проверять, будут ли эти искусственно созданные рибосомы синтезировать белок. Таким образом, он мог убирать по одному белку, чтобы определить, какие из них необходимы. Примерно как при выпечке хлеба можно убирать по одному ингредиенту, чтобы понять, какие из них действительно необходимы. В случае с рибосомой Гарри по очереди изымал по одному белку, и практически ничего не происходило: рибосома продолжала работать. Это вызывало разочарование и озадачивало. Где же были эти белки-ферменты, выполняющие ключевые функции?

В 1972 г. студент Джонатан Чейрз работал в лаборатории Гарри над дипломом, и Гарри предложил ему принципиально новый подход. Было известно, что вещество кетоксал особым образом взаимодействует с гуаниновыми основаниями в РНК, добавляя к ним несколько атомов и не влияя при этом на окружающие белки. Возня с рибосомными белками никуда не привела. Может быть, нужно оставить их в покое и попробовать «поиграть» с РНК?

Они использовали такую же систему синтеза белка, которую применил Маршалл Ниренберг при расшифровке генетического кода: берем рибосомы кишечной палочки (обработанные кетоксалом или не обработанные), добавляем искусственно полученную цепочку поли-У в качестве мРНК и наблюдаем за синтезом полифенилаланина – цепочки из аминокислот. Когда Гарри с Джонатаном впервые обработали рибосомы кетоксалом, оказалось, что он полностью останавливает синтез белка[134]. Более того, из сотен Г в каждой рибосомной РНК с кетоксалом прореагировали только 10, но этого оказалось достаточно, чтобы пустить под откос весь «состав», то есть обрушить синтез белка[135]. Рибосоме очень не понравилось вмешательство в ее РНК.

Результаты эксперимента означали, что ключевые функции связывания тРНК выполняются рибосомной РНК, а совсем не рибосомными белками[136]. Гарри почувствовал себя так, как если бы его Ferrari только что сорвалась с автотрассы, идущей вдоль побережья Калифорнии, и упала в Тихий океан. В какую сторону теперь двигаться?

Чтобы разгадать тайну рибосомы, Гарри пришлось стать специалистом по РНК. Так часто случается в науке: ученый работает над одной гипотезой, а результаты внезапно показывают, что истина может скрываться совершенно в другом направлении. В очень похожей ситуации оказался и я спустя десяток лет, когда моя лаборатория занималась поиском неуловимого белкового фермента, который должен был прятаться где-то в реакциях сплайсинга, а в итоге мы поняли, что РНК сама управляет собственным сплайсингом. Никогда не бывает абсолютно ясно, куда сворачивать на таких развилках, и многие исследователи настолько погружены в свою специальную область, что не хотят совершить шаг в сторону. Как говорится в известном афоризме (обычно приписываемом Черчиллю), «люди иногда спотыкаются об истину, но большинство из них поднимаются и спешат прочь как ни в чем не бывало»[137].

Тем не менее не таков был Гарри Ноллер. Он знал, что для понимания функции рибосомной РНК надо знать ее структуру. Однако в 1972 г. структура РНК была еще практически непостижима. Исключение составлял лишь трилистник тРНК. Гарри понимал, что чем крупнее РНК, тем сложнее будет выяснить ее строение, и это было плохо, потому что две из трех рибосомных РНК у всех видов были огромными. У E. coli в одной рРНК насчитывалось 1542 нуклеотида, а в другой – 2904. Третья была меньше, всего 120 нуклеотидов, но это все равно больше, чем в тРНК.

Озарение снизошло на Гарри в 1975 г., когда он был в творческом отпуске. Получив больше времени для работы в библиотеке, он прочел недавнюю статью Карла Везе, микробиолога из Иллинойсского университета. Спустя несколько лет Карл откроет архей – совершенно новый домен живых организмов, обитающих в серных горячих источниках Йеллоустонского национального парка и в других на первый взгляд непригодных для жизни местах. Уже в 1975 г. Карл со своим сотрудником Джорджем Фоксом установили двухмерную структуру самой мелкой рибосомной РНК, состоящей из 120 нуклеотидов. Они использовали тот же подход, который применялся для расшифровки структуры трилистника тРНК в 1960-х гг. У них были последовательности малой рибосомной РНК из дюжины различных организмов, в основном бактерий, но была и одна лягушка. Форма следует за функцией, поэтому исследователи предположили, что, поскольку все эти РНК, вероятнее всего, выполняют в рибосоме одну и ту же роль, все они будут сворачиваться одинаково, несмотря на различия в последовательности нуклеотидов у разных видов. Среди множества способов, которыми можно было свернуть РНК, соблюдая правило комплементарности А-У и Г-Ц, была только одна форма, в которую можно было свернуть РНК всей дюжины организмов[138]. Гарри осенило: вот путь к расшифровке структуры больших рибосомных РНК, хотя дело может оказаться долгим и трудным[139].

Когда Гарри в том же году созвонился с Карлом Везе, оказалось, что они близкие по духу люди. Оба выделялись на общем фоне. 99 процентов ученых все еще думали, что именно белки в рибосоме выполняют наиболее трудную работу и создают новые цепочки аминокислот на основе информации в мРНК. Гарри и Карл составляли оставшийся 1 процент считавших, что этим занимается рибосомная РНК. «Они не воспринимали нас всерьез, – рассказывал Гарри[140]. – Но зато в течение десяти лет у нас не было конкурентов».

Поскольку Санта-Круз (штат Калифорния) и Урбана (штат Иллинойс) расположены не так уж близко друг к другу и сотрудничество осуществляли в основном по телефону и электронной почте, исследователи обменивались расшифрованными последовательностями коротких фрагментов рибосомной РНК. Эти фрагменты получали, измельчая РНК с помощью фермента рибонуклеазы Т1, который разрезает РНК после каждой буквы Г. Процесс был похож на то, как документ пропускают сквозь шредер. Это было необходимо, поскольку в то время умели секвенировать только короткие фрагменты РНК. Из рРНК длиной 1542 нуклеотида получалось более 100 «слов» – небольших нуклеотидных цепочек. Группы Везе и Ноллера выясняли, из каких букв состояли эти «слова» (например, ЦУЦАГ и УАЦАЦАЦЦГ). После того как были расшифрованы все «слова», входившие в состав рРНК, предстояло соединить их в одно длинное предложение. Это было так же сложно, как восстановить заново пропущенный через шредер документ. Только сделав все это, ученые готовы были объявить о полной расшифровке последовательности РНК из 1542 нуклеотидов[141]. Определив последовательность РНК, они смогли понять, какие части молекулы соединятся друг с другом, чтобы получилась свернутая РНК. Фокс и Везе сделали то же самое для самой малой рибосомной РНК (рРНК), а Франсуа Мишель позднее – для рибозимов.

Полученная в результате двухмерная схема рРНК была опубликована в 1980 г.[142] Она чем-то напоминала схему терминалов международного аэропорта О'Хара в Чикаго: множество выступающих в стороны от центрального помещения залов, часть которых образуют Y-образные ответвления.

Через год была получена двухмерная структура рибосомной РНК из 2904 нуклеотидов[143], с еще бо́льшим количеством «залов» и «терминалов».

РНК большой субъединицы рибосомы свернута в структуру со многими ответвлениями; здесь показана только та часть, которая катализирует транспептидазную реакцию (структура вверху справа). Изображенная на рисунке рибосома содержит две тРНК, присоединившиеся к соседним триплетным кодонам на мРНК. Одна тРНК несет растущую белковую цепь (геометрическими фигурами показаны пять разных аминокислот). В то же время другая тРНК доставила в рибосому следующую аминокислоту (одиночный темный кружок), которая должна присоединиться к белковой цепи. Поскольку трехмерный объект сложно отобразить на двухмерном рисунке, концы двух тРНК, несущие аминокислоты, изображены на удалении друг от друга. На самом деле в рибосоме они оказываются рядом

Полученные две карты Гарри и Карл назвали «базой». Эту информацию используют для планирования исследований и интерпретации результатов эксперимента сотни ученых по всему миру, занимающихся рибосомами. Однако полученных схем оказалось недостаточно. Катализатор работает не в двухмерном пространстве, и невозможно по-настоящему понять, как устроена эта главная молекулярная машина, не видя ее в реальных условиях. И, как обычно бывает, открытие принципов работы рибосомы не только способствовало развитию науки, но и позволило усовершенствовать антибиотики. О том, что это поможет спасать жизни, Гарри и помыслить не мог, когда приступал к разгадке тайны рибосомы.

Гарри Ноллер был почти единственным, кто верил, что секретная действующая сила в рибосоме – это РНК, но явно не единственным, кто хотел в этом разобраться. Биологи всего мира жаждали получить трехмерное изображение молекулярной машины, синтезирующей белки во всех живых организмах. Однако получить четкое изображение оказалось почти так же трудно, как сфотографировать лох-несское чудовище.

Как и в случае с тРНК и рибозимами, дежурным методом был рентгеноструктурный анализ. Ада Йонат начала работы по кристаллизации бактериальных рибосом в 1970-х гг. в израильском Институте Вейцмана в Реховоте. Наряду со многими другими исследователями из разных стран, бравшимися за эту задачу, она столкнулась с чрезвычайными трудностями; неудача следовала за неудачей. Ада могла бы сдаться, но ее обнадеживали сообщения, что рибосомы сами собой образуют кристаллические скопления у впадающих в спячку медведей и итальянских стенных ящериц[144]. Она предположила, что если у живых животных в холодных условиях рибосомы могут формировать упорядоченные кристаллоподобные скопления, то можно заставить их кристаллизоваться и в лаборатории[145].

К 1980 г. Йонат удалось вырастить кристаллы бактериальных рибосом[146], которые давали достаточно хорошую дифракцию рентгеновских лучей. Но для кристаллизации предпочтительны растворы с большой концентрацией соли, а в них бактериальные рибосомы были нестабильны, некоторые белки отделялись, так что получалась смесь неполных рибосомных частиц. Йонат с коллегами пришли к мысли, что у солелюбивых организмов рибосомы могут быть устойчивыми к высоким концентрациям соли. Поскольку неподалеку было Мертвое море, исследователи провели эксперимент с Halobacterium marismortui (дословно – «солевая бактерия Мертвого моря»), и в итоге эти рибосомы привели к победе[147].

При таком прогрессе на разных направлениях, казалось бы, трехмерная структура рибосомы со всеми ее тремя РНК и 55 белками вот-вот будет описана. Тем не менее на это ушло еще 15 лет. Так же было, когда Дженнифер Даудна и сотрудники моей лаборатории пытались разгадать доменную структуру рибозимов у тетрахимены. Оказалось, что получить хорошие кристаллы, дающие дифракцию рентгеновских лучей, – только половина успеха. Вторая половина – это опять решение проблемы тяжелых атомов. Чтобы рассчитать трехмерную структуру РНК, необходимы четкие данные по дифракции рентгеновских лучей молекулой РНК с тяжелыми атомами и без них. И здесь в дело вступили Том Стейц и Венки Рамакришнан.

До сих пор мы говорили о рибосоме как о едином целом. В действительности рибосома не целостная структура, она состоит из двух огромных комплексов, в каждом из которых есть РНК и белки. Эти комплексы – большая и малая субъединицы, они работают вместе, занимаясь синтезом белка у всех живых организмов. Малая субъединица рибосомы содержит вторую по величине из трех рРНК (состоящую из 1 504 нуклеотидов) и 22 белка. Она первая присоединяется к мРНК. Затем на сцену выходит большая субъединица рибосомы, состоящая из двух рРНК (размерами 2904 и 120 нуклеотидов) и 33 белков. В большой субъединице находится каталитический центр, который отвечает за присоединение аминокислот друг за другом для получения их цепи, которую мы называем белком. Эти подробности важны, поскольку следующие два действующих лица нашей драмы занимались разными субъединицами: Том Стейц – большой, а Венки Рамакришнан – малой.

У Тома Стейца к 1995 г. был уникальный опыт в сфере расшифровки структуры основных биологических молекулярных машин. Он определил структуры ДНК-полимераз, которые так реплицируют родительскую двойную спираль, что образуются две дочерние. Он определил структуры РНК-полимераз, которые копируют информацию с ДНК в виде РНК. Он определил структуру обратной транскриптазы ВИЧ, которая копирует информацию с РНК ВИЧ в виде ДНК, после чего эта ДНК встраивается в хромосому человека. И он определил структуру фермента, который присоединяет нужную аминокислоту к молекуле тРНК.

Но сможет ли Том взломать главную молекулярную машину? В 1995 г. он собрал команду из трех постдокторантов[148], готовых ввязаться в эту авантюру. К ним присоединился Питер Мур, давний друг и коллега Тома по Йельскому университету, специалист по рибосомам. В качестве источника рибосомных субъединиц они выбрали бактерию из Мертвого моря, пойдя по пути, проложенному Адой Йонат. Группа Стейца занялась, как уже было сказано, большой субъединицей, которая катализирует соединение аминокислот в белковую цепь. И чтобы понять структуру этой субъединицы, необходимо было решить пугающую проблему тяжелых атомов.

Как бывалый моряк, Том объяснил суть задачи через морские аналогии. Он сравнил измерения с помощью тяжелых атомов в рентгеноструктурном анализе с определением веса капитана методом вычитания веса корабля из суммарного веса корабля с капитаном. Если корабль – это маленькая парусная лодка, все получилось бы вполне корректно. Но если корабль – лайнер «Куин Мэри»? Тогда определить вес капитана путем вычитания веса «Куин Мэри» из суммарного веса судна вместе с капитаном будет затруднительно. А рибосома со своими 250 000 атомами была молекулярным аналогом «Куин Мэри»[149].

Переломный момент наступил, когда группа Стейца обнаружила, что «взвесить капитана» можно, если… использовать чрезвычайно тяжелого капитана. Это был кластер из 18 атомов вольфрама, которые удалось поместить в определенную щель на рибосомной субъединице. Вольфрамовые нити обычно применяют в традиционных лампах накаливания, но и тут вольфрам помог пролить свет на структуру субъединицы. В течение следующих лет в лаборатории Стейца появлялись все более качественные фотографии большой субъединицы, и в 2000 г. было получено совершенно четкое изображение[150].

Каково это – описать трехмерную структуру биомолекулярной машины? Представьте себе, что существует хрустальный дворец, который долгое время был покрыт огромным покрывалом. Сотни исследователей использовали непрямые методы, чтобы выяснить, что там внутри, – наверняка должны быть кухня, столовая, множество спален и ванных комнат. Но никто не знает, как именно эти комнаты расположены. Какова планировка и как поэтажный план соответствует функциям дворца? А затем в одно мгновение структура разгадана. Огромное покрывало срывают, и теперь сквозь прозрачные стены можно разглядеть то, что находится внутри, и даже пройтись по всем комнатам. Вот каково это – разгадать атомную структуру с помощью рентгеноструктурного анализа! Вы внезапно видите в деталях все то, что ученые исследовали, выясняли, о чем строили предположения на протяжении многих лет в лабораториях по всему миру, вы понимаете, какие идеи были верны, а какие ошибочны.

Для группы Стейца прозрение наступило, когда они взглянули на каталитический центр большой рибосомной субъединицы и увидели, что он состоит исключительно из РНК. Поблизости не было никаких белков.

Все, что Гарри Ноллер и Карл Везе предполагали насчет ведущей роли РНК, основываясь на своих кропотливых экспериментах и чуткой интуиции, подтвердилось. По сути, рибосома – это рибозим, РНК-структура со свойствами катализатора[151]. Конечно, РНК связана с целым рядом белков, так же как РНКаза Р взаимодействует с белком, который помогает ферменту хорошо функционировать в условиях клетки. Но сердце рибосомы – это чистая РНК.

Однако пока наша история рассказана лишь наполовину. Да, расшифровка структуры большой субъединицы рибосомы, сделанная с атомной точностью, показала, что именно рибозим, а не белковый фермент катализирует соединение аминокислот в белковую цепочку. Но как обеспечивается считывание кода с мРНК и подбор соответствующих тРНК, посредников, определяющих, какие именно аминокислоты будут соединены? Секреты расшифровки матрицы хранились в малой субъединице рибосомы.

Венки Рамакришнан вырос в Индии, защитил диссертацию по физике в Университете Огайо, а затем стал постдокторантом в Йельском университете, где и увлекся рибосомами. В 1995 г. Венки перешел в Университет Юты и занялся изучением структуры малой субъединицы рибосомы. Вместе со своим аспирантом Билом Клемонсом он усовершенствовал методы выращивания хороших кристаллов из рибосомных субъединиц, а затем столкнулся лицом к лицу с пугающей проблемой тяжелых атомов. Они перепробовали все тяжелые атомы, которые смогли добыть, и, так же как в случае с большой субъединицей в лаборатории Стейца, именно кластеры атомов вольфрама помогли пролить свет на искомую структуру. В 1999 г. Венки перебрался в Англию, в знаменитую лабораторию молекулярной биологии в Кембридже, и примерно через год его группа завершила работу, начатую в Юте. Они расшифровали структуру малой субъединицы рибосомы[152]. Вгляделись в свой собственный хрустальный дворец и рассмотрели его в мельчайших подробностях.

Но кое-чего в структуре малой субъединицы не хватало. Членов семьи, живших во дворце, – мРНК и тРНК – не было дома просто потому, что их не внесли в смесь для кристаллизации. Рибосому изучают, чтобы понять, как происходит синтез белка, но, как мы уже выяснили, рибосома не производит белок сама по себе. Ей необходимы мРНК, чтобы определить, какой белок делать, и тРНК, чтобы доставить соответствующие аминокислоты. Поэтому затруднительно понять, как создаются белки, просто глядя на структуру рибосомы. Нужно увидеть, куда именно входят мРНК и тРНК. Нужно увидеть дом вместе с его обитателями.

Задача визуализировать рибосому вместе со всеми ее обитателями – тРНК и мРНК – выпала Джейми Кейту, который, став постдокторантом, перебрался в лабораторию Гарри Ноллера в Калифорнийском университете в Санта-Крузе. К счастью, он был хорошо подготовлен к такой работе: в Йельском университете он вместе с Дженнифер Даудной занимался определением структуры рибозима. А в 1999 г. Джейми и Гарри удалось впервые в истории получить кристаллическую структуру рибосомы в функциональном состоянии, вместе с тРНК и мРНК[153]. Однако эти кристаллы недостаточно хорошо преломляли рентгеновские лучи, и фотография получилась слегка размытой. Как будто исследователи смотрели на свой хрустальный дворец через запотевшие очки.

Тем не менее два изображения – одно немного расплывчатое изображение целой рибосомы со всей ее компанией, полученное Джейми и Гарри, и второе очень четкое изображение свободной малой субъединицы от Венки – великолепно дополнили друг друга[154]. Наложив расположение мРНК и тРНК на изображение структуры в хорошем разрешении, можно было увидеть, как основания рибосомной РНК помогают считывать кодоны на мРНК. Одни основания рРНК удерживали тРНК на месте, пока другие регулировали положение мРНК, чтобы информация была прочитана.

Все вращалось вокруг РНК. Функциональные участки, удерживающие тРНК и мРНК, почти полностью состояли из РНК. Важнейший участок, соединяющий малую рибосомную субъединицу с большой? Опять преимущественно РНК. Помогал только один из 22 белков малой субъединицы. Все остальные процессы однозначно были организованы РНК.

За сорок лет наука прошла путь от расшифровки кода мРНК до поразительно детального описания того, как он считывается при синтезе белка. И вновь Ноллер и Везе вышли победителями. На этот раз они, верившие, что синтез белка осуществляется главным образом с помощью РНК, а роль белков второстепенна, больше не были в однопроцентном меньшинстве. Чтобы поверить, надо увидеть. Теперь весь ученый мир был вынужден признать главенство РНК.

Для биохимиков вроде нас с Гарри открытие того факта, что синтезирующая белки рибосома работает почти полностью за счет РНК, оказывается умопомрачительным, но вы можете задать логичный вопрос: а какое до этого дело всем остальным? Есть ли какая-то практическая польза от понимания структуры и функции рибосомной РНК?

Возьмем антибиотики. Изучив структуру рибосомы, мы смогли понять невообразимые раньше вещи, а именно как действуют многие антибиотики, как возникает устойчивость к антибиотикам и как их можно улучшить в будущем.

Эффективный антибиотик должен нарушать жизненно важные процессы у бактерий, не затрагивая при этом сходные процессы у человека. Может показаться, что рибосома – плохая мишень, ведь ее основные характеристики – наличие большой и малой субъединиц, связывание тРНК и мРНК, катализация соединения аминокислот друг с другом – присутствуют у всех живых организмов. Но оказалось, что за миллиарды лет, прошедшие с тех пор, как наши эволюционные пути разделились, человеческие и бактериальные рибосомы достаточно разошлись, чтобы можно было найти лекарства, подавляющие только бактериальные рибосомы. Примечательно, что примерно половина всех используемых антибиотиков нацелена именно на бактериальные рибосомы[155].

В 1960-х гг., когда антибиотики только начали широко использоваться, исследователей очень интересовал механизм их действия. Как раз в то время были открыты рибосомы, мРНК, тРНК, был расшифрован генетический код и медицина сблизилась с молекулярной биологией. Оказалось, что многие распространенные антибиотики, в том числе те, которыми лечат туберкулез, гонорею и даже акне, убивают бактерий, подавляя их способность синтезировать белки. Ученые быстро обнаружили, что эти антибиотики связываются непосредственно с бактериальными рибосомами.

Здесь полезно ощутить масштаб. Типичная молекула антибиотика состоит примерно из 100 атомов, тогда как в бактериальной рибосоме их 250 000. Рибосома в 2500 раз больше лекарства. Подобно палке, вставленной в колесо, маленький препарат может заблокировать большую рибосому, если свяжется с функционально важным участком внутри нее. Если бы вещество присоединялось только к наружной поверхности рибосомы, оно не причинило бы вреда и никогда не смогло бы действовать как антибиотик. Поэтому особенностями присоединения антибиотиков к бактериальной рибосоме интересуются не только фармакологические производственные компании, но и представители фундаментальной науки, выясняющие, как работает рибосома.

Устойчивые к антибиотикам бактерии дали на сей счет одну из первых подсказок. И тогда, и сейчас, как только какой-либо антибиотик начинает широко применяться, находится везучий микроб с мутацией, защищающей его от антибиотика. Пока его соседи гибнут, этот счастливчик размножается и начинает преобладать в популяции. Это кажется неизбежным: как только появляется антибиотик, эффективно убивающий какие-нибудь бактерии, возникает устойчивость к антибиотикам. Каким образом мутация в рибосоме способна вызывать такую невосприимчивость к антибиотику?

Вновь представим себе рибосому в виде паровоза, движущегося по рельсам матричной РНК. Каждый антибиотик действует как палка, вставленная в колесо, но палка строго определенной формы и размера. Одной палкой можно ткнуть в поршень и помешать ему двигаться, другую просунуть в ведущее колесо, так что оно перестанет вращаться. Существует сотня способов, как разными палками блокировать паровоз; так же разные антибиотики могут испортить рибосому. Теперь представьте себе, что один паровоз слегка отличается от других. Его поршни другого размера, а паз у ведущих колес более узкий. Палки, выводящие из строя другие паровозы, не могут повлиять на наш, он неуязвим для них.

Поскольку сопротивляемость антибиотикам встречается часто, ученым не составило труда заполучить разные устойчивые к ним рибосомы. В каждом случае исследователи стремились выяснить, где именно кроется мутация, обеспечившая невосприимчивость к антибиотикам: в рибосомной РНК или в одном из многочисленных рибосомных белков? Начиная с 1970-х гг. ученые секвенировали рибосомную РНК и рибосомные белки из невосприимчивых клеток и находили примеры, подтверждавшие и первый вариант, и второй. Иногда устойчивость к антибиотикам обеспечивалась изменением аминокислотной последовательности в рибосомном белке. Иногда причиной служило изменение последовательности оснований в рибосомной РНК. Именно на эти случаи вначале опирались Гарри Ноллер, Карл Везе и другие исследовавшие РНК коллеги, укрепляя только зарождавшуюся идею, что рибосомная РНК критически важна для работы рибосомы.

Все доказательства этого тезиса были, однако, лишь косвенными. Поэтому примерно в 2000-х гг. получил развитие рентгеноструктурный анализ рибосом, и многие исследователи, в том числе Том Стейц, Венки Рамакришнан и Ада Йонат, ухватились за возможность увидеть воочию, в какой конкретно участок рибосомы попадает антибиотик. В идеале нужно было изучать рибосомы патогенных бактерий, на которых направлены антибиотики. Но такие рибосомы не были кристаллизованы, поэтому антибиотики добавляли к рибосомам родственных бактерий и наблюдали за происходившим, предполагая, что механизм действия будет таким же.

В лаборатории Стейца были получены фотографии семи различных антибиотиков, связывающихся с большой субъединицей рибосомы, и все они соединялись с ее каталитическим центром[156]. Каждый препарат связывался с некоторыми отличиями, но во всех случаях связывание явно мешало концам тРНК соединиться с рибосомой для участия в синтезе белка. Более того, все препараты связывались именно с большой рибосомной РНК, а не с белком. Следовательно, если вы собираетесь выиграть в шахматной партии против рибосомы, лучше атаковать короля – РНК, а не одну из белковых пешек.

Было обнаружено, с каким участком на большой рибосомной субъединице связывался эритромицин, эффективный при лечении таких бактериальных инфекций, как стрептококковый фарингит[157]. Во время синтеза белка рибосома выводит строящийся белок через «выходной туннель». Оказалось, что эритромицин присоединяется таким образом, что блокирует этот «выходной туннель» и тем самым препятствует удлинению растущей белковой цепи. Том Стейц в шутку называл этот механизм подавления «молекулярным запором»[158].

Рибосома использует информацию, содержащуюся в кодонах мРНК, чтобы соединять аминокислоты в белковую цепь. В результате транспептидазной реакции, показанной дуговой стрелкой (вверху), цепочка становится на одну аминокислоту длиннее (внизу справа). Затем происходит транслокация, то есть мРНК сдвигается так, что две тРНК перемещаются в другие участки рибосомы, освобождая место для следующей тРНК (несущей аминокислоту, обозначенную ромбом, – внизу слева). Цикл повторяется с каждой аминокислотой

У малой субъединицы рибосомы есть свои уязвимые места, которыми могут воспользоваться антибиотики. Группа Венки сфотографировала шесть антибиотиков, в том числе стрептомицин и тетрациклин, прилипших к малой рибосомной субъединице[159]. Благодаря фотографии каждого из них появились некоторые идеи, как работает рибосома. Рассмотрим спектиномицин, который используется для лечения гонореи. Один из трюков рибосомы – транслокация, перемещение кодона мРНК со связанной с ним тРНК внутри рибосомы из одного места в другое. Это должно происходить всякий раз, когда кодон считывается, чтобы освободить место для входа следующей тРНК.

Для этого транслокационного шага должна подвинуться «голова» малой субъединицы. Это как кивание: каждый кивок – транслокационный шаг. Спектиномицин – жесткая молекула, этакая маленькая палка, которая встает в узкую бороздку на рибосомной РНК рядом с точкой поворота головы. Она не дает голове кивать, блокируя транслокацию. Не удивительно, что спектиномицин убивает бактерии: если их рибосомы лишаются возможности «кивать», они не могут вырабатывать ни один из необходимых им для жизни белков.

Используя различия в структуре рибосом, специалисты в области биомедицины смогут получить новый мощный инструмент для борьбы с бактериями, устойчивыми к антибиотикам. При разработке лекарственных средств на основе структурной информации ученые исследуют поверхность белка, вызвавшего заболевание, или, как в случае с антибиотиками, – любого важного белка патогенной бактерии. Обнаружив углубление в функционально важной части молекулы-мишени, ученые используют компьютерные программы для анализа возможности устойчивого соединения молекул (докинга), чтобы предсказать форму небольшой молекулы лекарства, которая встанет в это углубление, как палка в колесо. Существенно, что разработка лекарств на основе структурной информации невозможна без подробной модели самой структуры, и для рибосомы эта информация теперь имеется.

За двадцать с лишним лет образ РНК в научном мире радикально изменился. В середине 1960-х гг. РНК считалась посредником, передающим сообщения между ДНК и белками. Была еще рибосомная РНК, которая ничего не кодировала, но выполняла какие-то функции в механизме синтеза белков; изначально считалось, что она служит каркасом для ключевых белков. Были также транспортные РНК, в которых видели важные адаптерные молекулы, соединяющие кодоны мРНК с правильными аминокислотами. Но тогда еще не было понятно, что эти представления лишь предвестники множества будущих открытий важных некодирующих функций РНК. Затем, в 1980-х гг., обнаружилось, что РНК может быть биокатализатором, что мяРНК управляют сплайсингом мРНК и что рибосомные РНК непосредственно отвечают за один из главных жизненных процессов – синтез белка. РНК превратилась из бэк-вокалистки в примадонну.

Из-за всех этих потрясений были переписаны учебники биологии, заболевания человека стали более понятными и лучше излечимыми. Но исследование РНК не просто изменило науку здесь и сейчас. Оно пролило свет и на один из самых старых и фундаментальных вопросов: как зародилась жизнь на нашей планете?

Впервые я попал в Меса-Верде на юго-западе Колорадо более пятидесяти лет назад. Я уже забыл подробности, но все еще помню пробежавший по коже утренний холодок, когда я карабкался по деревянной лестнице, ведущей вверх по склону.

«Не поскользнитесь, – предупредила сотрудница Национального парка. – Ступеньки еще в изморози».

Помню также вид, который открылся мне с вершины: полные великолепия стены древнего поселения из песчаника, поблескивающие золотом на утреннем солнце. В огромной расщелине скалы аккуратно разместились 150 крохотных по нынешним меркам строений. И хотя это место опустело почти тысячу лет назад, каменные башни и скальные жилища на удивление хорошо сохранились.

Когда остальные члены нашей группы поднялись наверх, сотрудница парка предложила нам собраться над сооружением, выложенным камнем, которое, казалось, было утоплено в скале.

«Предки пуэбло построили эти кивы для религиозных церемоний, – объяснила она. – Если вы посмотрите вниз, то увидите большую круглую конструкцию – это очаг. А теперь видите маленькое круглое отверстие в полу? Это сипапу. Пуэбло верили, что именно через него в мир пришли первые люди».

Когда я впервые увидел Скальный дворец, то уже знал, что в каждой культуре есть своя история творения мира. Это могла быть насыщенная неделя библейского Бога, описанная в Книге Бытия, Гея, появившаяся из вспышки света, или предки пуэбло, проползшие через сипапу. Вопрос о том, как мы здесь оказались, как на Земле появилась жизнь, наверное, самый фундаментальный из всех. Хотя я длительное время занимался изучением молекулярных основ жизни, я многие годы считал, что этот вопрос – как все начиналось – больше адресован философам и теологам, а не химикам вроде меня.

И все же к такой проблеме можно подойти с точки зрения химии. В этом случае вопрос, как появилась жизнь на Земле, сводится к выяснению того, как неорганические вещества превратились в органические. Давным-давно на нашей планете не было никаких, даже самых примитивных живых существ – одни лишь камни и океан. Затем, мгновение спустя, появилась жизнь. На что были похожи эти первые живые существа? Как они возникли?

Любые разговоры о происхождении жизни надо начать с определения, что именно означает это пятибуквенное слово. У представителей науки нет по этому вопросу единого мнения. Говорят, что определений понятия «жизнь» столько же, сколько и людей, которые пытаются дать это определение[160]. Многие определения строятся на способности к росту, проведению метаболических реакций и возможности отвечать на стимулы. Однако самое простое определение жизни содержит только два основных требования: живой организм должен самовоспроизводиться и мутировать.

Первое из этих требований – размножение, или репликация, – кажется очевидным. Для живого существа необходимо продолжать себя в следующих поколениях. Это отличает его от неживых объектов, таких как камни, которые не размножаются. Вы можете наблюдать за камнем хоть миллионы лет и не увидите у него никакого потомства. Второе требование – мутации – может вызвать удивление. Разве мутации не что-то плохое? Мутации – это случайные ошибки, возникающие при копировании наследственной информации, передаваемой следующему поколению. Если говорить о репликации нуклеиновых кислот, то четыре буквы ДНК– или РНК-алфавита копируются с высокой, но не абсолютной точностью. Если бы копирование было идеальным, то примитивная жизнь так и осталось бы примитивной. Неоткуда было бы взяться другим формам, которые нужны для естественного отбора. Мутации необходимы, чтобы потомки жизненной формы могли улучшаться с каждым поколением и адаптироваться, то есть эволюционировать.

Итак, давайте для нашего обсуждения переформулируем вопрос о происхождении жизни в вопрос «Как могли появиться первые структуры, способные к репликации и эволюции?».

Когда ученые задумывались о происхождении жизни, то сразу сталкивались с проблемой. Если для жизни нужна репликация, то должны быть какие-то инструкции, какая-то информация, которая будет передаваться от поколения к поколению. У современных организмов эта информация записана в двойной спирали ДНК. Но хотя ДНК и содержит инструкцию для жизни, она не способна сама себя копировать без посторонней помощи. Маленькие белковые устройства репликазы действуют как молекулярные ксероксы, копируя каждую материнскую нить ДНК в виде дочерней, превращая одну двойную спираль в две одинаковые молекулы.

Именно поэтому происхождение жизни часто выглядит как самая первая проблема курицы и яйца. Ученые так и не смогли выяснить, что появилось раньше – информационная молекула или синтезирующая, ДНК или белок, который ее копирует. Необходимо, чтобы оба компонента возникли одновременно. Но сама мысль, что в результате случайных химических реакций могли сразу получиться и ДНК, и мощный белковый копировальный аппарат, причем в одном и том же месте, кажется неправдоподобной. Столь же невозможно, что один из этих необходимых компонентов появился первым, а затем ждал миллионы лет, пока внезапно не возникнет другой. Эти вещества обладают ограниченной стабильностью, определяемой законами химии, и они бы исчезли, если бы не воспроизводились.

Итак, чтобы решить проблему происхождения жизни, ученым необходимо было как-то отыскать молекулу, которая могла играть обе роли – и хранить информацию о жизни, и копировать ее. Другими словами, быть одновременно и курицей, и яйцом.

После того как наша исследовательская группа открыла способную к самостоятельному сплайсингу РНК у тетрахимены, мне стали звонить из других университетов с предложением рассказать о нашей работе с рибозимами. Это была важная возможность, особенно для молодого профессора. Каждый раз, когда вы представляете свои исследования, в аудитории могут сидеть как специалисты, которые будут потом рецензировать ваши статьи или оценивать заявки на грант, так и аспиранты, у которых может возникнуть желание пройти постдокторантуру в вашей лаборатории. Более того, привлекая внимание к заслугам ваших стажеров, вы помогаете им впоследствии занять хорошие вакансии. Иначе говоря, в науке, как и в других областях, большую роль играет налаживание связей.

Поэтому я старался не отказываться от приглашений. В течение года после публикации нашей ключевой работы по рибозимам в 1982 г.[161] я колесил по стране, прочел лекции в дюжине университетов и посетил пять конференций. Это было довольно утомительно, но я продвигал наше исследование, получал ценные замечания и знакомился с новыми людьми. Я чувствовал, что двигаюсь в нужном направлении, однако мне было невдомек, что меня вот-вот с головой затянет в темную дыру сипапу.

В ноябре 1983 г. я прибыл в Лос-Анджелес для вечернего выступления в Калифорнийском университете, ожидая, что предстоит еще один научный семинар. Меня пригласила некая эволюционная группа, что было не удивительно, потому что биохимики постоянно говорят про эволюцию. Дарвин описывал эволюцию галапагосских вьюрков в процессе формирования приспособлений к разным типам корма; точно так же современные биологи наблюдают, как в процессе эволюции бактерии вырабатывают устойчивость к антибиотикам, а молекулы в клетке приобретают новые функции. Поэтому, выступая с докладом, я ожидал провокационных вопросов вроде «Как, по-вашему, интрон тетрахимены вообще оказался в ее геноме?». Я размышлял над такими вещами и был готов поделиться своими предположениями, а другие члены эволюционной группы могли бы выдвинуть свои идеи. Но вместо этого я услышал вопросы типа такого: «Могли бы, по вашему мнению, рибозимы объяснить, как появилась жизнь на нашей планете?» Над проблемой происхождения жизни как таковой я до того практически не задумывался, поэтому почувствовал себя совершенно не готовым ответить что-либо полезное. Я закончил семинар, полностью обескураженный вопросами, которыми меня засы́пали участники.

Начнем с того, что я даже не знал о существовании сообщества ученых, размышляющих о таких далеких событиях. И не понимал, чем их заинтересовало мое исследование. Одним из участников того семинара был Билл Шопф – профессор палеонтологии из Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе, который изучал похожие на клетки микроскопические окаменелости в очень древних породах. Вскоре он объявил, что камни Варравуна в Австралии содержат, видимо, одноклеточные жизненные формы возрастом 3,3–3,5 млрд лет[162]. Важный вопрос заключался в том, что было внутри этих клеток: ДНК, РНК или что-то совсем иное? В отличие от поверхности окаменевших клеток, их внутренние элементы слишком малы, чтобы сохранить свою форму при превращении в камень. Будь иначе, у Шопфа были бы подсказки об их составе и структуре.

Мысль, что окаменелости могут рассказывать о древних событиях, была, конечно, не нова для меня. Еще когда я учился в четвертом классе Школы доктора Ховарда в Шампейне (штат Иллинойс), я собирал окаменелости моллюсков, некогда живых существ, погребенных в известняке. У меня была книга «Путеводитель по горным породам и минералам» (Guide to Rocks and Minerals), где рассказывалось, что окаменелости бывают заключены в железные конкреции. Когда я находил камень соответствующей формы, то ставил его на ребро, разбивал своим геологическим молотком фирмы Estwing и, к своему удивлению, обнаруживал внутри прекрасно сохранившийся отпечаток папоротника. Он ждал меня 300 млн лет. Поэтому я привык думать об окаменелостях каменноугольного периода, но самое начало жизни на Земле ускользало от моего внимания – до того вечера в Лос-Анджелесе.

Вернувшись домой, я начал изучать некоторые старые научные публикации. И тут меня осенило. На протяжении десятилетий ученые, занимавшиеся вопросами происхождения жизни, размышляли о том, как на Земле почти 4 млрд лет назад могла зародиться первая самовоспроизводящаяся система. И когда они столкнулись с проблемой курицы и яйца, то уже тогда предположили, что решением может оказаться РНК.

Предположительный механизм саморепликации РНК. Короткие фрагменты РНК образуют пары с уже существующей цепочкой (показана светло-серым), а затем соединяются вместе с помощью рибозима (показан темно-серым). Образуется двуцепочечная РНК. После этого за счет энергии солнечного света она «расплавляется» на две нити. Темная нить сворачивается, образуя новый рибозим, а светлая остается матрицей для следующего раунда репликации

Очевидно, что РНК – это информационная молекула. Матричная РНК несет информацию о порядке, в котором аминокислоты соединяются в пептид. У РНК-вирусов молекула РНК хранит генетическую информацию, необходимую вирусу для осуществления своего инфекционного цикла. Поэтому никто не сомневался, что РНК может нести информацию – инструкции, необходимые для запуска жизни. Вопрос был в том, может ли она воспроизводить себя, реплицироваться в Древнем мире, лишенном белков. Без репликации было бы невозможно получать следующее поколение молекул РНК из предыдущего.

Этой проблемой занимался в том числе и британский химик Лесли Орджел, который к тому времени преподавал в Институте Солка в Ла-Холье (Калифорния). Начиная с 1960-х гг. Лесли страстно мечтал о таких молекулах ДНК и РНК, которые могли бы воспроизводиться сами, без участия белков, решив тем самым проблему курицы и яйца. Как он заявил в своей широко цитируемой работе[163] 1968 г., нет доказательств, что такая молекула когда-либо существовала, и вряд ли примитивные виды РНК способны приоткрыть книгу жизни.

Однако затем он интригующе добавил: «Нельзя быть полностью уверенным».

В этой статье Лесли подбирался к идее РНК-катализатора. Поэтому эволюционная группа при Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе, а также, как я вскоре узнал, и сам Лесли были невероятно взволнованы нашим открытием рибозимов. РНК на самом деле одновременно была носителем информации и могла ее реализовывать физически! Но это еще не всё. Реакции самосплайсинга, которые катализировал наш интрон, включали в себя образование новых химических связей между РНК-нуклеотидами[164]. Это была именно такая активность, которой должна была обладать рибозимная репликаза, чтобы обеспечить самоудвоение РНК. Возможно, все началось с РНК, а белки и ДНК появились позже[165].

Хотя в тот вечер на встрече с эволюционистами я был весьма озадачен, позже я все больше и больше погружался в вопросы происхождения жизни. В 1980-е гг. я часто вел с Лесли в его кабинете с видом на Тихий океан оживленные дискуссии о возможности самокопирования рибозимов.

Какой бы захватывающей ни казалась химикам вроде меня и Лесли идея этого «РНК-мира», я вынужден признать, что не так уж хотел бы посетить подобное место. Если бы мы смогли перенестись в прошлое и осмотреться, что бы мы увидели на ранних этапах развития жизни на Земле? Практически ничего без помощи очень мощного микроскопа. Все события происходили бы в капельках воды в камнях или, как считают некоторые ученые, в аэрозольных частицах в атмосфере либо же в дымящихся гидротермальных источниках на дне океана. На тот момент жизнь еще не обладала достаточной силой, чтобы создать что-то заметное, не говоря уж о том, чтобы изменить всю планету. Нам надо было бы проверить множество разных мест на Земле, дабы найти даже самые ничтожные следы жизни, а затем подождать еще около 100 млн лет, чтобы только что зародившаяся РНК запустила процесс эволюции.

В наши дни строительство стены начинается с покупки кирпичей. Вы приезжаете на склад или на кирпичный завод, выбираете цвет и оформляете заказ. Через пару дней прибывает грузовик, выгружает поддоны кирпичей, и вы можете начинать строительство. Но в эпоху, когда еще не было складов и магазинов, кирпичи приходилось делать самостоятельно. Надо было смешать глину, солому и воду, затем залить смесь в прямоугольные формы и оставить их сушиться на солнце. И только когда набиралось достаточное количество кирпичей, можно было начинать строить стену.

РНК, как и стена, строится из отдельных кирпичиков – нуклеотидов четырех типов: А, Г, Ц и У, и у каждого из них есть три фосфатные группы, благодаря которым нуклеотиды химически активны и готовы соединяться друг с другом. Поэтому каждый, кто пытается утверждать, что РНК была первой жизненной формой на планете, должен вначале предложить удовлетворительное объяснение, как появились кирпичики для РНК.

Сегодня большинство исследователей, изучающих саморепликацию РНК, покупают свои кирпичики (нуклеотиды) в очищенном виде на химических складах и получают их с помощью экспресс-доставки. В предбиологические времена, еще до появления первых живых организмов, эти кирпичики должны были возникать спонтанно из веществ, присутствующих в окружающей среде. Такие вещества были самыми обычными, как глина, солома и вода, необходимые для создания всем знакомых кирпичей.

Углерод, водород и азот, встречающиеся в каждом нуклеотиде, могли попасть туда из простых атмосферных газов, например из синильной кислоты, которая содержит все эти три элемента. Считается, что в атмосфере молодой Земли было много синильной кислоты. Она ядовита для людей и других созданий, но никого из нас в то время еще не было. Кислород, необходимый для макромолекул, мог быть получен из воды. Пятый элемент, использующийся в нуклеотиде, – фосфор. Он мог быть получен из апатитов – земных пород, богатых фосфатами, или же из космических метеоритов, которые бомбардировали Землю.

Насколько вероятно, что нуклеотиды, из которых состоит РНК, могли самопроизвольно возникнуть из тех веществ, которые были на древней Земле около 4 млрд лет назад? В 1952 г. химики-первооткрыватели Стенли Миллер и Гарольд Юри показали, что многие из аминокислот, содержащихся в современных белках, могут возникать в смеси простых газов, которую воспламеняли с помощью электрической искры, имитирующей молнию[166]. Могли ли «кирпичики» РНК – нуклеотиды – так же возникнуть в предполагаемых предбиологических условиях? И действительно, британский химик Джон Сазерленд показал в лабораторных опытах, что вещества, содержащие азот, кислород, углерод, водород и фосфор, которые, скорее всего, присутствовали на молодой Земле, могут вступать в химическую реакцию с образованием нуклеотидов[167].

Однако возникла досадная проблема. Условия, в которых происходят реакции для образования кирпичиков У и Ц, резко отличаются от условий, необходимых для кирпичиков А и Г. И эти два набора условий в значительной степени несовместимы. Но если мы собираемся построить стену из кирпичей разного цвета, нам надо собрать их в одном месте. Прорыв в решении этой проблемы был сделан в лаборатории немецкого биохимика Томаса Карелла в 2019 г. Начав с молекул, которые, вполне вероятно, могли существовать на Земле до появления жизни, Карелл с коллегами обнаружил, что циклическая смена влажных и сухих условий позволяет всем четырем нуклеотидам накапливаться практически в одном котле[168]. Вполне возможно, что на молодой Земле действительно могли чередоваться сухие и влажные условия. День сменял ночь, так же как это происходит и сейчас. Прохладной ночью на камнях конденсировались капли воды, растворявшие некоторые вещества, а днем вода под лучами солнца испарялась. Из-за испарения вначале повышалась концентрация веществ в воде, что способствовало химическим реакциям, прежде чем капля полностью высохнет. Картина в те далекие дни была отнюдь не спокойной. Тогда Земля была жестоким местом, с грозами, кометными бомбардировками, извержениями вулканов и мощным ультрафиолетовым излучением от Солнца. Такие суровые условия обеспечивали необходимую энергию для химических реакций.

Давайте допустим, что Сазерленд, Карелл и другие ученые, занимающиеся абиотическим синтезом нуклеотидов, правы и в древности на Земле могли образовываться нуклеотиды. Тогда у нас есть кирпичи и мы готовы к постройке нашей стены – «стены», которая представляет собой цепочку нуклеотидов, способную к самовоспроизводству. В начале 1980-х гг. Лесли Орджел провел в своей лаборатории в Институте Солка эксперимент, в принципе подтвердивший такую возможность. Он синтезировал нуклеотиды и показал, что если их нагревать при высокой концентрации, то они спонтанно начнут соединяться друг с другом, образуя короткие РНК-цепочки. Если он использовал нуклеотиды Ц, то в продуктах реакции находились ЦЦ, ЦЦЦ, ЦЦЦЦ, ЦЦЦЦЦ. Когда затем Орджел добавлял нуклеотиды Г, они выстраивались вдоль нитей из Ц, соединяясь связями Г-Ц, и образовывали короткие цепочки из Г.

И хотя сборка таких коротких фрагментов РНК без могущественной помощи какого-либо фермента была захватывающим зрелищем[169], эта реакция проходила очень медленно и неэффективно. Возможно, рибозимы и были тем самым недостающим ингредиентом. Что, если бы одна из случайно возникших цепочек у Лесли оказалась достаточно длинной и с последовательностью нуклеотидов, дающих ей возможность сворачиваться и катализировать образование собственной копии? Тогда вместо случайного роста урывками РНК могла бы воспроизводить себя целиком и полностью, и это позволило бы ей стать той самой чудо-молекулой, которая катализировала жизнь на Земле.

Вероятность, что это произойдет спонтанно, наверняка намного меньше, чем шанс выиграть в лотерею «Мегамиллионы» (Mega Millions). Но все-таки игра в предбиологическую РНК могла происходить в миллионе мест на Земле. И если ушло 100 млн лет, чтобы найти победителя, – не проблема, жизнь могла подождать.

Реальна ли саморепликация РНК, катализируемая РНК? Возможно ли воспроизвести такое явление в лаборатории? Если это еще не докажет, что РНК была отправной точкой для всего живого, то хотя бы продемонстрирует такую возможность.

В январе 1986 г., через два года после упомянутого семинара в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе, меня пригласили выступить в Калифорнийском университете в Сан-Франциско. Обедали мы с главой отделения биохимии Брюсом Альбертсом в кафе, расположенном в Парнассус Хайтс над парком «Золотые ворота». Брюс, ставший впоследствии президентом Национальной академии наук, часто приглашал ученых в Сан-Франциско, чтобы они поделились своими новейшими открытиями.

«На прошлой неделе здесь был Джек Шостак, – сказал Брюс, оторвавшись от сэндвича с пастрами. – Он был очень увлечен вопросом происхождения жизни и перенаправил всю свою исследовательскую программу на изучение вашего рибозима». Я чуть не подавился оливкой из своего салата нисуаз. Джек Шостак был молодой профессор из Гарварда, уже заработавший солидную репутацию за открытие основ рекомбинации ДНК – механизма, посредством которого фрагменты ДНК передаются от одной хромосомы к другой. Прежде всего я испытал радость, что такой продвинутый генетик будет заниматься нашим рибозимом. При этом меня бросило в дрожь от страха, потому что я знал, настолько он изобретателен и продуктивен. А что, если Джек проведет все те эксперименты, которые я хотел бы выполнить сам, но сделает это быстрее?

Джек считал, что происхождение жизни – важнейший вопрос науки, остающийся без ответа. Он верил тогда и верит сейчас, что если кто-то сможет в лаборатории воспроизвести условия, которые были на Земле в древности, и получить саморепликацию РНК, то можно будет с уверенностью сказать, как зародилась жизнь на планете.

У Джека было секретное оружие – Дженнифер Даудна. Еще до того, как Дженнифер пришла в постдокторантуру к нам в лабораторию, она вместе с Джеком работала над диссертацией в Массачусетской больнице общего профиля. Главной целью ее диссертации было выйти за пределы реакций такого типа, которые описал Лесли Орджел, – когда образуются случайные цепочки РНК, – а вместо этого получить реплицирующуюся и выполняющую полезную функцию РНК. Дженнифер хотела заставить рибозим копировать в пробирке самого себя, доказав тем самым возможность осуществления одного из ключевых этапов в появлении РНК-репликации. Когда Джек приходил утром на работу, то первым делом шел к столу Дженнифер, где происходило самое интересное. И часто ей было чем поделиться.

В природе все реакции разрезания и соединения РНК, которые катализирует рибозим тетрахимены, происходят на этой же самой цепочке РНК. Начиная с 1986 г. моей исследовательской группе удавалось продемонстрировать, что интронная часть рибозима может катализировать реакцию разрезания и склеивания других молекул РНК[170]. Но наша система была ограничена определенными последовательностями РНК, которые мог обрабатывать рибозим, поэтому ей не хватало универсальности, необходимой для саморепликации РНК. В 1989 г. Дженнифер и Джек объявили о прорыве – они так модифицировали рибозим тетрахимены, что он мог копировать более длинные цепочки РНК, содержащие разные последовательности.

Чтобы оценить, насколько это открытие важно для понимания происхождения жизни, нам надо вернуться назад, к основам того, как копируются в природе нуклеиновые кислоты – ДНК и РНК. Никогда этот процесс не происходит напрямую. Одиночная нить нуклеиновой кислоты не может просто скопировать себя, как, например, в схеме ГГГ → ГГГ. Вначале эта нить должна сделать комплементарную копию, которая послужит матрицей, и только затем благодаря магии комплементарных связей можно синтезировать копию исходной молекулы. Другими словами, если вы хотите удвоить цепочку ГГГ, сначала вам надо получить ЦЦЦ, а уже ее, в свою очередь, использовать для образования другой цепочки ГГГ: ГГГ → ЦЦЦ → ГГГ.

Этот процесс немного напоминает отливку трехмерной фигуры из формы. Допустим, у вас есть гипсовый садовый гном и вы хотите сделать его двойника. Сначала вам надо получить инвертированную копию, чтобы использовать ее как форму. Все структурные элементы вашего гнома – длинная борода, остроконечная шляпа, округлый живот – в вашем слепке станут впадинами. Как только у вас появится такая форма, вы сможете залить ее гипсом и получить точную копию оригинального гнома. В истории с репликацией РНК рибозим с репликазной активностью будет садовым гномом, а комплементарная ему цепочка РНК – формой для отливки. Эта комплементарная цепочка не будет обладать каталитической активностью, но может быть использована как матрица для образования все новых рибозимов. И наконец, образование нового рибозима по матричной РНК можно сравнить с заливкой гипса в форму с целью изготовления еще одного гнома.

Джек и Дженнифер в 1989 г. перестроили рибозим тетрахимены таким образом, чтобы, получив матричную последовательность РНК, он катализировал создание комплементарной цепочки. Начав с формы, они смогли сделать еще одного гнома. Их модифицированный рибозим был способен копировать любые РНК-последовательности. А для саморепликации РНК использовались две последовательности, а именно последовательность рибозима и комплементарная ей, по схеме: рибозим → комплементарная последовательность → рибозим. Словом, Джек и Дженнифер воссоздали один ключевой этап на пути от РНК-кирпичиков до саморепликации[171].

Однако оставался еще один пробел, который Дженнифер и Джек хотели устранить: самая длинная цепочка, которую удавалось получить, составляла 42 нуклеотида. На то время это был мировой рекорд, но это было намного меньше, чем 400 нуклеотидов, необходимые для рибозима тетрахимены. То есть наши коллеги могли сделать, так сказать, только голову гнома, а не его целиком.

Чтобы преодолеть это ограничение размера, Дженнифер предприняла два важных шага. Во-первых, она переключилась с рибозима тетрахимены на другой объект. Исследователи из Университета штата Нью-Йорк в Олбани примерно тогда открыли у бактериофага рибозим SunY[172], который, как и рибозим тетрахимены, обладал способностью к самостоятельному сплайсингу, но был примерно вдвое короче[173]. Половина дела была сделана. Затем Дженнифер решила разделять и властвовать. Она разделила рибозим SunY на три фрагмента, которые могли в пробирке найти друг друга и соединиться за счет комплементарности оснований. Полученные кусочки были настолько малы, что рибозим SunY мог их копировать. Таким образом, Дженнифер с Джеком показали, что фрагменты РНК, которые могли спонтанно возникнуть в реакциях, описанных Лесли Орджелом, способны соединяться друг с другом, образуя маленький самокопирующийся механизм[174].

Итак, ученые сумели воспроизвести в пробирках многие этапы, которые требовались для саморепликации РНК в предбиологические времена. Речь идет о синтезе нуклеотидов, соединении их в РНК-цепочки, наличии рибозима, который способен скопировать самого себя на отдельную молекулу РНК[175]. И хотя никому еще не удалось успешно воспроизвести весь процесс возникновения саморепликации РНК, то есть смешать в пробирке нуклеотиды РНК, а затем вернуться и найти собранные молекулы РНК, занятые копированием самих себя, предположение, что жизнь началась с мира РНК, теперь кажется по меньшей мере правдоподобным.

Исследователи предъявили убедительные доказательства, что жизнь на Земле могла зародиться как РНК-мир, однако оставалась еще одна большая нерешенная проблема. Кучка молекул в капле жидкости – это, конечно, еще не организм. Даже самый примитивный организм должен быть отдельной сущностью, отличной как от окружающей среды, так и от других организмов. Он должен быть помещен в конверт.

Сэндвич с тунцом заматывают в пищевую пленку, которая удерживает его части вместе и защищает от загрязнения, и точно так же клетки животных окружены мембраной, которая оберегает их по крайней мере от некоторых опасностей окружающей среды, например от ядовитых веществ, бактерий, вирусов и других патогенов. Да, это не идеальная защита, и некоторые чужаки все-таки проникают внутрь клетки, но подавляющее большинство остается снаружи. Клеточные мембраны состоят из липидов – жироподобных молекул, которые обладают удивительным свойством самостоятельно собираться в двуслойную пленку, достаточно прочную, чтобы выдержать давление, непроницаемую и потому защищающую внутреннее содержимое клетки и гибкую настолько, чтобы позволить клеткам двигаться и делиться.

В первичном РНК-мире наличие мембраны тоже дало бы преимущество древним клеткам. Например, мембрана могла бы не допускать конкурирующие молекулы РНК. Подобно тому как у собак заводятся блохи, которые извлекают выгоду из своего местонахождения, но не приносят собаке никакой пользы, реплицирующиеся молекулы РНК страдают от паразитических РНК, которые находятся рядом с ними и крадут у самовоспроизводящейся молекулы питательные вещества, ничего не давая взамен. Мы наблюдали, как они появляются в лабораторных эволюционных экспериментах, и они неизбежно возникали бы в природе. Мембрана могла бы удерживать самореплицирующиеся молекулы РНК внутри, не пропуская к ним внешние паразитические РНК.

Более того, оболочка облегчает эволюцию. Если множество самовоспроизводящихся молекул РНК смешаны в одной капле воды, то все РНК в этой капле получат выгоду от любой мутации, которая улучшит функцию репликации одной молекулы РНК. И хотя подобное альтруистическое поведение кажется достойным восхищения, оно тормозит эволюцию. Чтобы организмы совершенствовались со временем, необходимо «выживание наиболее приспособленных». Только если они разделены и отличаются друг от друга, один из них сможет получить выгоду от благоприятной мутации и выиграть у других. Это выглядит циничным, но, когда речь идет об эволюции видов, индивидуальный эгоизм в долгосрочной перспективе приносит пользу сообществу.

Исследовательская группа Джека Шостака изучала, как нуклеиновые кислоты ведут себя внутри мембранных оболочек в так называемых протоклетках – их искусственно имитировали на основе представления о том, как могли бы выглядеть самые первые клетки. Такую нуклеиновую кислоту, как РНК, очень просто заключить внутри протоклетки. Для начала вам надо смешать образующие оболочку жирные кислоты с нуклеиновыми кислотами, затем дать смеси высохнуть и снова ее развести или же подвергнуть ее циклу замораживания и оттаивания. Тогда нуклеиновые кислоты окажутся случайным образом окружены оболочкой[176]. Джек заметил, что внутри протоклеток нуклеиновые кислоты могут образовывать более длинные цепочки, как предполагал Лесли Орджел[177]. Его группа также показала, что протоклетки могут расти, а затем делиться, хотя и не с той регулярностью, как это делают современные клетки. Благодаря протоклеткам мы сделали еще один шаг вперед к воспроизведению саморепликации РНК в лабораторных условиях. Они показали нам вероятное развитие истории о том, как неживая материя превратилась в живую.

Ученые всё ближе к тому, чтобы доказать, по крайней мере в лабораторных экспериментах, что жизнь могла зародиться в виде РНК-мира. Им удалось провернуть впечатляющий трюк и продемонстрировать, что в пробирке РНК может воссоздавать саму себя. Но предстоит еще долгий путь, чтобы достичь амбициозной цели. Исследователям требуется выяснить, как полный цикл саморепликации рибозима мог происходить в протоклетках в климатических условиях древней Земли. А также необходимо узнать, как протоклетки делятся и мутируют, как возникло то эволюционное событие, которое подтолкнуло зарождение жизни на Земле.

Однако даже если химикам удастся сделать все это в лаборатории, фундаментальная проблема останется: происхождение жизни не столько научный, сколько исторический вопрос. То, что РНК может самореплицироваться в лаборатории, еще не доказывает, что она это сделала, запустив тем самым весь эволюционный процесс, приведший к развитию жизни на Земле в том виде, в котором мы эту жизнь знаем[178]. Узнаем ли мы когда-нибудь, действительно ли РНК или какая-либо родственница современной РНК заселяла окаменелые клетки Билла Шопфа? Есть ли хоть какая-то возможность узнать, как 4 млрд лет тому назад на Земле зародилась жизнь?

Когда мы смотрим сверху на киву и пытаемся заглянуть в темноту сипапу, то словно устанавливаем сквозь тысячелетия связь с другими людьми, которые размышляли о происхождении жизни. А поскольку мы живем в век ошеломительного развития науки, нам может показаться, что где-то там, в темноте, виднеется форма, очень похожая на РНК. Но до конца мы в этом не уверены. Наука может лишь предполагать. Наука может сказать, что «это правдоподобно». Но наука, вероятно, никогда не сможет доказать, что жизнь началась с РНК.

Невозможность подобного доказательства всегда вызывала у меня некоторое беспокойство касательно исследований происхождения жизни, которые развивались очень спекулятивным образом, граничащим с бульварной шумихой. Я помню, как поделился своим беспокойством с Лесли Орджелом во время одной нашей дискуссии в Институте Солка.

«Пока вы открываете фундаментальные принципы химии нуклеиновых кислот, – ответил он, – эти исследования имеют ценность, а происхождение жизни – интересная тема, к которой их можно привязать». Я всегда считал, что это было очень хорошо сказано. Конечно, Лесли произнес это со своим удивительно авторитетным британским акцентом, что могло повлиять на мою готовность с ним согласиться.

В конечном счете происхождение жизни, возможно, самый фундаментальный вопрос, который был порожден изучением природы РНК. Но, как ни заманчиво размышлять о роли РНК в начале истории жизни, настало время вернуться к тому, как РНК меняет наше настоящее и будущее. Она уже служит катализатором революционных изменений в медицине и, как мы увидим, способна продлить здоровую жизнь за пределы существующих природных возможностей.

В моем университетском кабинете есть полка, заполненная сувенирами, привезенными с конференций, и маленькими презентами от бывших студентов. Среди них стоит зеленая пластиковая бутылка с таблетками – кто-то подаривший ее решил, что это любопытная вещь. Этикетка на бутылке смело обещает «омоложение клеток через активацию теломеразы».

Эти таблетки – одна из многочисленных новомодных добавок, которые продают, чтобы нажиться на ореоле «бессмертия» вокруг содержащего РНК фермента теломеразы. На Amazon можно купить «защищающий теломеры» крем против старения под названием Youth Shots («порции молодости») по, казалось бы, разумной цене 25,99 доллара. А тем временем капсулы, содержащие «активатор теломеразы», фирмы HealthyCell набрали 400 пятизвездочных оценок, и один покупатель даже утверждает в отзыве, что этот продукт вылечил его мать от болезни Альцгеймера. В другом отзыве написано, что продукт еще и «прекрасен на вкус».

Мне очень странно видеть, как этот фермент – теломераза – всего за несколько десятилетий превратился из мудреной научной темы в модное слово. В 1980-х гг. теломераза была интересна только нашей небольшой группе исследователей, изучавших прудовую тину. Теперь теломеразу рекламируют как настоящий источник вечной молодости, и это часть многомиллиардной индустрии борьбы со старением[179]. Может показаться, что стремление к бессмертию – призрачная мечта сумасбродных миллиардеров. Между тем оно, по крайней мере на клеточном уровне, уже существует. И теломераза – тот секретный ингредиент, который позволяет достичь его.

Теломераза состоит из белков и РНК. Она добавляет защитный генетический материал к теломерам – кончикам хромосом – и тем самым поддерживает способность клеток к делению. Хромосомы – форма хранения ДНК в ядре клетки, их можно сравнить с нитями жемчуга. Без теломеразы нить укорачивается при каждом делении клетки, поскольку на конце нити становится на одну жемчужину меньше. В результате такого укорачивания клетки в определенный момент перестают делиться, наступает состояние сенесценции – клеточного старения, то есть старость. Но теломераза этого не допускает. Она добавляет жемчужины к концам хромосомной нити, предотвращая старение, так что клетки остаются вечно молодыми.

В эмбрионе человека теломеразу вырабатывают быстро делящиеся клетки, но к моменту рождения в большинстве наших клеток этот процесс прекращается. Из правила есть некоторые исключения; так, теломераза продолжает вырабатываться в настоящем чуде природы – наших стволовых клетках. В отличие от большинства других клеток, которые при делении производят две идентичные копии самих себя, стволовые клетки делятся асимметрично, то есть их потомки отличаются друг от друга. Одна дочерняя клетка становится новой стволовой клеткой, как и исходная, а другая дифференцируется, превращаясь в одну из клеток того типа, которые нужно восполнить где-то в организме, например в коже, крови, волосяных луковицах, пищеварительной системе либо в других внутренних органах или тканях. Контролируемое деление стволовых клеток позволяет организму человека обновляться, и этот жизненно важный процесс был бы невозможен без теломеразы. Но хотя наличие теломеразы необходимо для правильной работы стволовых клеток, оно характерно и для большинства форм рака. Когда опухолевые клетки получают возможность восстановить выработку теломеразы, они избегают нормального процесса клеточного старения и обретают бессмертие, что часто имеет для нас летальные последствия.

Так что же такое теломераза – чудо или проклятие? Поскольку этот использующий РНК механизм дает клеткам возможность непрерывно делиться и не стареть, вполне естественно поинтересоваться, можно ли как-то использовать его силу для продления жизни не одиночной клетки, а всего организма. Может ли лекарство на основе теломеразы действительно остановить ход наших биологических часов? Чтобы приступить к ответу на этот вопрос, вернемся к моему любимому одноклеточному пушистому комочку – тетрахимене.

В 1977 г., еще будучи в постдокторантуре Массачусетского технологического института, я поехал на своем стареньком Volvo с механической коробкой передач из Кембриджа в Нью-Хейвен, чтобы провести день в Йельском университете, в лаборатории профессора Джо Галла. В то время я еще только начинал понимать, какие возможности открывает исследователям микроскопическое создание тетрахимена, и мне захотелось посетить лабораторию Джо, потому что он недавно обнаружил у этой тетрахимены необычный набор генов, организованных в виде мини-хромосом, каждая из которых была меньше одной тысячной длины самой маленькой хромосомы человека. Эти отдельные молекулы ДНК содержали гены рибосомальной РНК тетрахимены. Несколько лет спустя с их помощью будет показан самосплайсинг РНК и впервые описана каталитическая функция РНК, но тогда ничего похожего на горизонте еще не маячило.

Я провел утро в лаборатории Джо, наблюдая в микроскоп, как тетрахимена мечется в капле, ограниченной предметным стеклом, пока не наступило время обеда. Коллеги Джо отвели меня в кафе на верхнем этаже Биологической башни Клайна, самого высокого здания в кампусе, дизайн которого явно не учитывал важность горизонтальных связей для взаимодействия и сотрудничества. Но нам всем гораздо интереснее было поговорить о науке, а не критиковать архитектуру. Группа Джо восхищалась исследованиями их австралийского постдокторанта Лиз Блэкберн.

Лиз выросла в Хобарте на острове Тасмания. С ранних лет она заразилась страстью к науке и, увлекшись биологией, прошла путь до аспирантуры Кембриджского университета. Там, работая с двукратным нобелевским лауреатом Фредом Сенгером, она секвенировала ДНК бактериального вируса – по тем временам это было прорывом. Когда после защиты диссертации она перебралась в Йельский университет, прежний опыт оказался очень полезен для ее новой необычной темы, и она быстро добилась прогресса в определении последовательности ДНК на концах мини-хромосом тетрахимены.

В то время Лиз не думала о новых направлениях в исследовании рака или процесса старения. Не подозревала она и о том, что откроет новую главу в науке о РНК. Ей казалось, что она просто расскажет еще одну историю про ДНК. Никто из нас не знал, какой может быть ДНК на концах хромосом – линейных молекул ДНК, хранящихся в клеточных ядрах большинства организмов.

Эти кончики хромосом, так называемые теломеры (в дословном переводе с греч. – «конечные части»), давно вызывали интерес у специалистов по биологии клетки, в частности у Германа Меллера, наблюдавшего за дрозофилами, и Барбары Мак-Клинток, работавшей с кукурузой. В 1938 г. и Мак-Клинток, и Меллер показали, что при разрыве хромосомы, возникшем в природе спонтанно или при воздействии рентгеновским излучением, концы хромосомы в месте разрыва становятся нестабильными и либо сливаются с другими обломанными концами, либо разрушаются. В то же время естественные концы хромосомы каким-то образом защищены от подобных проблем. Теломеры на концах хромосом похожи на эглеты – тонкие пластиковые наконечники шнурков, сохраняющие шнурки в целости и не дающие им распускаться. Но в течение последующих 40 лет никто не мог понять, что именно позволяет хромосомным теломерам служить как эглеты.

Тысячи лабораторий по всему миру занимались секвенированием центральных участков хромосом, тех, где располагались гены, а концы оставались почти совсем неизученными. Поэтому Лиз и Джо направили свои усилия туда. Что за ДНК на концах хромосом и как защищены эти концы? Было решено использовать мини-хромосому тетрахимены, поскольку ее 10 000 копий в клетке обеспечивают достаточно материала, чтобы можно было надеяться на успех.

На конце каждой мини-хромосомы тетрахимены Лиз обнаружила нечто очень странное – короткую шестибуквенную последовательность, которая повторялась много раз[180]. В одной нити повторялось ТТГГГГ, в другой повторялась комплементарная последовательность ЦЦЦЦАА:

Это было все равно что читать роман и в конце вполне внятного предложения обнаружить «и т. д. и т. д. и т. д. и т. д. и т. д. и т. д. и т. д.». Одно «и т. д.» может иметь смысл, но длинная череда таких сокращений кажется совершенно излишней. Что это может значить?

Лиз и Джо сейчас широко известны тем, что впервые определили последовательность нуклеотидов в теломере. Но интересно, что в статье 1978 г., в которой они сообщали об открытии, слово теломера просто не упоминается. Авторы объявили, что впервые расшифрована теломерная последовательность, не назвав этого слова! К чему такая осторожность? Мини-хромосомы тетрахимены так необычны, они настолько меньше хромосом человека и представлены в таком большом количестве копий, что ученые сочли слишком самонадеянным утверждать, что теломеры больших, нормальных хромосом будут такими же. Так часто бывает в науке. Если ваша работа намного опередила свое время, далеко не сразу окружающие, да и вы сами сможете оценить ее значение.

Нужен был еще один решающий эксперимент, чтобы Лиз Блэкберн убедилась, что имеет дело именно с теломерами. В 1978 г. она перешла в Калифорнийский университет в Беркли на профессорскую должность, чтобы создать собственную лабораторию. На конференции в Нью-Гэмпшире в 1980 г. у Лиз завязался разговор с Джеком Шостаком, который тогда начал работать в Институте изучения рака Даны – Фарбера в Бостоне. Джек изучал хромосомы пекарских дрожжей. Он обнаружил, что если в клетки дрожжей ввести искусственные кольцевые молекулы ДНК, то они сохранятся там как мини-хромосомы, но введенные таким же образом линейные молекулы не выживали. Это казалось странным, потому что собственные хромосомы дрожжей – линейные молекулы, а не кольцевые.

Джек и Лиз задумались, не были ли эти линейные молекулы ДНК в дрожжах недолговечными из-за отсутствия на концах каких-то стабилизирующих элементов. Может быть, «шнуркам» нужны были эглеты. Единственными известными эглетами для ДНК были те, которые Лиз обнаружила на концах мини-хромосом у тетрахимены. Могут ли они выполнять такую же функцию и у дрожжей?

В 1982 г. Джек и Лиз совместно провели весьма дерзкий эксперимент. Они перенесли концевые участки ДНК тетрахимены – повторы ТТГГГГ – на концы фрагментов ДНК дрожжей. И догадка их оказалась верной. Кончики от ДНК тетрахимены позволяли поддерживать линейную ДНК в дрожжах в стабильном состоянии. Удивительный результат, учитывая огромную эволюционную дистанцию между этими организмами: тетрахимена так же далека от дрожжей, как и от человека.

Дженис Шампей, аспирантка из лаборатории Лиз, секвенировала концы линейной ДНК, которая теперь оставалась стабильной в дрожжах[181]. Результат мог оказаться незначительным. Она могла бы увидеть, что концы по-прежнему закрыты повторами ТТГГГГ, полученными от тетрахимены. Но обнаружилось нечто примечательное. Молекулы ДНК теперь заканчивались не «и т. д. и т. д. и т. д. и т. д. и т. д.», они заканчивались «и т. д. и т. д. и т. д. и т. д. и т. д. и т. п. и т. п. и т. п. и т. п.». Последовательность «и т. п.» оказалась той самой, которой дрожжи закрывают концы своих собственных полноразмерных хромосом. Это была собственная теломерная последовательность дрожжей[182]. Таким образом, хотя тетрахимена и дрожжи были совершенно разными видами, их теломерная последовательность оказалась достаточно похожей, чтобы дрожжи, обнаружив импортированную теломеру («и т. д.»), начали добавлять собственные теломерные повторы к концам мини-хромосомы.

Дженис, Джек и Лиз могли найти только один способ интерпретации результатов секвенирования. Повторяющаяся последовательность у тетрахимены «и т. д.» и у дрожжей «и т. п.» должна выполнять роль теломеров, придавая стабильность концам хромосом и не позволяя им разрушаться. Более того, у дрожжей обнаружился фермент, удлиняющий теломеры, который распознаёт повторы тетрахимены как «затравку» и добавляет к ним собственные последовательности. Это означало, что у тетрахимены тоже должен существовать удлиняющий теломеры фермент, который создает повторы своего типа. Все так красиво складывалось, но насколько это была устойчивая конструкция? Предположение будет подтверждено, если действительно удастся найти гипотетический фермент, удлиняющий теломеры. И новая аспирантка в лаборатории Лиз была готова взяться за эту задачу.

Кэрол Грейдер поступила в аспирантуру с трудом. Она страдала дислексией и неудачно сдавала стандартные экзамены. Но в отделении молекулярной биологии Калифорнийского университета в Беркли обратили внимание не только на результаты ее тестов, но и на ее исследования в колледже, которые были впечатляющими. Поэтому ей дали шанс[183]. Как оказалось, это было очень мудрым решением.

Кэрол, в свою очередь, была в восторге от возможности не только оказаться в Беркли, но и присоединиться к молодой лаборатории Лиз, где она взялась за амбициозное задание: выделить пока еще не обнаруженный фермент, удлиняющий теломеры у тетрахимены. Если фермент действительно существовал, то он должен был бы добавлять повторы ТТГГГГ к концам ДНК. Это было рискованное дело для начинающей аспирантки – найти то, чего еще никто не находил и чего может вообще не существовать. В то время Кэрол и представить себе не могла, что наградой ей будет не только ученая степень, но еще и возможность разделить Нобелевскую премию и заглянуть вглубь проблемы бессмертия.

Кэрол пришла в лабораторию к Лиз в мае 1984 г. Она сразу же начала выращивать тетрахимену в литровых стеклянных бутылках, вскрывать клетки и выделять из них ядра. Ведь удлинение теломер происходит в клеточном ядре, поэтому именно там, вероятно, следует искать фермент, катализирующий удлинение. Она замораживала и размораживала ядра, в результате чего они разрывались и содержимое их высвобождалось. Цель манипуляций состояла в том, чтобы выделить секретный ингредиент, удлиняющий концы хромосом после деления клетки.

Кэрол и Лиз решили, что для стимулирования активности фермента не обязательно наличие целой хромосомы, достаточно конца теломеры, где этот фермент работает. Поэтому Кэрол синтезировала короткие нити ДНК, состоящие из повторов ТТГГГГ (теломерная последовательность тетрахимены), надеясь, что этого хватит, чтобы фермент распознал теломеру и удлинил ее за счет дополнительных повторов. Затем она инкубировала эти искусственные теломеры в пробирках с разрушенными ядрами тетрахимены. К Рождеству 1984 г. Кэрол была в полном восторге, поскольку увидела, что ДНК удлиняется многократными повторами шестинуклеотидной последовательности ТТГГГГ. Она нашла прямое доказательство существования фермента, который позднее назовут теломеразой[184].

Как часто бывает в науке, едва найден ответ на один большой вопрос, сразу возникает следующий. Откуда белковый фермент может знать, как создать определенную последовательность ДНК длиной в шесть нуклеотидов? Такого фермента еще не находили. ДНК– и РНК-полимеразы способны синтезировать длинные последовательности нуклеотидов, но они это делают не самостоятельно, им нужна ДНК в качестве матрицы. Обратные транскриптазы вроде тех, что найдены у ретровирусов, используют РНК в качестве матрицы, чтобы синтезировать ДНК. Поэтому Кэрол и Лиз решили выяснить, существует ли РНК, служащая матрицей при добавлении последовательностей ТТГГГГ. Ведь с помощью комплементарности пар оснований РНК легко могла бы «запомнить» ТТГГГГ, надо было просто использовать А для обозначения Т и Ц для обозначения Г. Чтобы проверить предположение, Кэрол решила предварительно обработать препарат теломеразы тетрахимены рибонуклеазой – ферментом, расщепляющим РНК, и посмотреть, изменится ли что-нибудь.

В тот день в январе 1986 г., когда у Кэрол был эксперимент, я случайно оказался в Беркли, где проводил кафедральный семинар. Я встретился с Лиз и Кэрол утром, и Кэрол рассказала мне о своей идее проверить наличие РНК-компонента в теломеразе. Теперь, когда я был специалистом по РНК, меня взволновала возможность того, что РНК способна еще и на такой фокус. В течение дня, в перерывах между запланированными встречами с разными сотрудниками, я заглядывал к Кэрол в лабораторию и спрашивал, как продвигается эксперимент. И для меня, и для нее это была немного игра, поскольку на проведение такого опыта требуется минимум день, поэтому было маловероятно, что она будет сообщать мне что-то новое каждые полчаса[185].

Результаты эксперимента Кэрол я узнал, уже вернувшись в Боулдер. Она действительно обнаружила, что при обработке рибонуклеазой активность теломеразы нарушается. Большинство ферментов – белки, они не содержат РНК, и рибонуклеаза на них не действует. Но для работы теломеразы требовалась РНК[186]. Таким образом, теломераза оказалась еще одним исключением из правила, гласящего, что «все ферменты – белки». В этом списке исключений уже были наш рибозим тетрахимены, родственные ему самосплайсирующиеся РНК у других видов, рибонуклеаза Р и рибосомное устройство для синтеза белков. Теперь к приведенному перечню добавилась и теломераза.

Еще через несколько лет, в 1989 г., Кэрол удалось выделить и секвенировать РНК-компонент теломеразы тетрахимены. К тому времени она защитила диссертацию в Беркли и перешла в лабораторию Колд-Спринг-Харбор – знаменитый центр биологических исследований Джима Уотсона на берегу Лонг-Айленда. И надо же, оказалось, что РНК содержала участок ААЦЦЦЦ, который кодировал теломерную последовательность ТТГГГГ у тетрахимены[187]! Это подтвердило их с Лиз догадку, что РНК-матрица задает последовательность ДНК, добавляемую к концам хромосом.

Вскоре была идентифицирована и соответствующая человеческая РНК-теломераза, которая служит матрицей для похожей повторяющейся последовательности ТТАГГГ в теломерах человека[188]. Итак, РНК оказалась в центре еще одного жизненно важного процесса – формирования кончиков хромосом для сохранения целостности генома.

Все исследования теломер и теломеразы были вызваны любопытством, желанием на фундаментальном уровне понять, как работают хромосомы. Первоначально никакого медицинского применения полученных результатов не предполагалось. Но все изменилось, когда появились дополнительные данные о роли теломеразы в развитии рака и старении.

Теломераза использует короткий участок своей РНК в качестве матрицы для определения последовательности, которая будет добавлена к концу теломеры ДНК. Нуклеотиды добавляются по одному с помощью белка (серый овал). На рисунке показана теломерная последовательность тетрахимены ТТГГГГ. Когда теломерный повтор полностью сформирован, ДНК может проскользнуть вдоль РНК, освободив место для добавления следующего повтора (не показано)

Леонард Хейфлик родился в Филадельфии в 1928 г. и вырос там же. Ему было около десяти лет, когда он получил в подарок от дяди набор юного химика фирмы Gilbert и с благословения своих весьма наивных родителей организовал в подвале собственную лабораторию[189], где экспериментировал с изготовлением взрывчатых смесей и сооружением ракет. Учась в Пенсильванском университете, он открыл для себя биологию и в 1958 г. устроился на работу в исследовательский центр – Институт Вистара в Филадельфии. Там Хейфлик научился мастерски выращивать культуры человеческих клеток, например клеток легких без вирусов и рака, поэтому фармацевтическая промышленность была заинтересована в приобретении такого материала для производства вакцин, в частности от краснухи (немецкой кори).

При выращивании культур нормальных человеческих клеток рост их через некоторое время останавливался. Другие исследователи списывали такие случаи на неаккуратность в работе, а потому просто выбрасывали культуру и запускали новую. Хейфлик же был настолько выдающимся экспериментатором и скрупулезным наблюдателем, что понял значение происходящего. Нормальные человеческие клетки могут делиться ограниченное количество раз[190], обычно 50–60, а затем стареют. Состарившиеся клетки не умирали: они обретали другую форму, у них изменялся метаболизм, то есть они продолжали жить, но больше уже не делились. Сейчас мы говорим, что такие клетки достигли предела Хейфлика.

Сам Хейфлик всегда считал, что ограниченная продолжительность способности к делению у нормальных человеческих клеток вполне логична. Клеткам кожи, печени, костей и мозга необходимо делиться у эмбриона и у маленького ребенка, но у взрослого человека количество делений должно иметь предел. Это особенно важно потому, что альтернативный вариант – неограниченное деление – главная черта опухолевого процесса.

Но кто подсчитывает, через сколько делений уже прошла клетка? Должны существовать какие-то часы. Когда была открыта теломераза, возникло предположение, что такими часами может быть длина теломер и что она-то и обеспечивает предел Хейфлика. Поскольку теломераза не работает в большинстве клеток человеческого организма, неполная репликация теломер приводит к их укорачиванию, и таким образом запускается процесс старения. И напротив, у постоянно делящихся организмов, таких как тетрахимена и дрожжи, так же как и у раковых клеток, теломераза всегда работает, поддерживая длину теломер, и предел Хейфлика не будет достигнут никогда. В 1990 г. специалист по клеточной биологии Кел Харли, который тогда руководил лабораторией в Университете Макмастера в Канаде, привлек Кэрол Грейдер к проверке гипотезы об укорачивании теломер. Они провели исследование, имевшее большое значение, и обнаружили, что по мере старения определенного типа клеток человеческой кожи теломеры там неуклонно укорачиваются – примерно на 50 пар оснований за каждое деление клетки[191]. Корреляция была интригующей, но, как корректно заключили Кел и Кэрол, оставалось «неизвестно, является ли эта потеря ДНК причиной старения», то есть действительно ли клетки перестают делиться из-за этого.

Действительно ли теломераза – «фермент бессмертия», способствующий долгой жизни? А как же обнаруженные учеными доказательства, что повышенная активность теломеразы – характерная черта всех типов рака[192]? Означает ли это, что теломераза может быть хорошей мишенью при лечении рака? Из-за этих предполагаемых связей теломеразы со старением и раком биотехнологические и крупные фармацевтические компании начали охоту на белковую часть теломеразы, поскольку, как бы ни была важна теломеразная РНК, она может действовать только в сочетании со своим белковым партнером. Чтобы раскрыть секреты теломеразы, нужно было выделить всю систему вместе – РНК и белок, что было чрезвычайно сложно, поскольку даже в опухолевых клетках, где она оказывает такое страшное воздействие, теломеразы мало. Всего лишь щепотки этого ингредиента достаточно, чтобы клетки бесконечно продолжали свое деление. Для решения проблемы с очисткой теломеразы понадобился швейцарский постдокторант Йоахим Лингнер и маленькое создание из пруда – дальняя родственница тетрахимены.

Теломерная гипотеза старения. Человеческим клеткам необходима теломераза для сохранения длины теломер. В большинстве соматических клеток нет теломеразы, поэтому в процессе деления клетки теломеры укорачиваются. Когда теломеры становятся слишком короткими, клетка перестает делиться и стареет. Восстановление активности теломеразы – одно из условий возникновения опухоли. Опухолевые клетки бессмертны и всегда способны к делению

Швейцарский Базель – фантастический город на Рейне. Около этого города Швейцария встречается с Германией и Францией. Это город великолепных художественных музеев – на фоне бетонных стен демонстрируются грандиозные картины Ротко с ошеломительными красками. Пять мостов перекинуты через Рейн, а между ними курсируют четыре городских парома Wilde Maa, Leu, Vogel Gryff и Ueli, позволяющие пересечь реку, не используя никаких моторов. Паромы гениально сконструированы: они используют естественную силу течения, чтобы пересечь реку в одном направлении, а затем руль поворачивают – и то же течение обеспечивает движение в обратную сторону. Не менее гениальны и научные исследования, которые выполняются в Базеле – в Базельском университете, Институте биомедицинских исследований имени Фридриха Мишера и двух ведущих мировых фармацевтических компаниях – Roche и Novartis.

В 1992 г. я приехал в биоцентр Базельского университета, чтобы провести научный семинар. Во время визита я познакомился с аспирантом Йоахимом Лингнером, который заканчивал диссертацию под руководством одного из ведущих швейцарских специалистов в области РНК[193]. Йоахим спросил, можно ли ему приехать в Боулдер, чтобы заняться выделением теломеразы. Предполагалось, что этот фермент содержит РНК-элемент, как показали Кэрол и Лиз. Также предполагалось, что у него обнаружатся один-два белковых компонента, участвующие в процессе удлинения ДНК. В 1993 г. я пригласил Йоахима в Боулдер и заверил его, что мы сможем добиться успеха там, где все компании потерпели неудачу, если будем работать с организмом, обладающим при удлинении теломер поразительной производительностью.

Я выбрал окситриху (Oxytricha nova) – существо, которое вместе с тетрахименой обитает в прудовом иле по всему миру. Я узнал про окситриху от своего коллеги Дэвида Прескотта, который выделил множество одноклеточных организмов из пруда на территории нашего университетского кампуса. Дэвид обнаружил нечто невероятное: у окситрихи было 100 млн мельчайших хромосом, в каждой из которых содержалось всего по одному гену. Поскольку у каждой хромосомы было два конца, в каждой клетке имелось 200 млн теломер. Для сравнения: у человека в большинстве клеток тела по 23 пары хромосом, то есть всего 46 хромосом, или 92 теломеры. Если предположить, что количество теломеразы будет зависеть от количества теломер, окситриха даст нам в миллионы раз больше шансов, чем было у исследовательских групп тех компаний, которые пытались выделить теломеразу из опухолевых клеток человека.

Подобно многим другим «ценным идеям», продвигаемым научными руководителями, мой план содержал некоторые недочеты. Как вскоре обнаружил Йоахим, окситриху сложно культивировать. Мы выращивали ее в открытых поддонах, предназначенных для выпечки лазаньи и купленных в местном универсаме сети King Soopers. Животные ползали вблизи дна, охотясь за бактериями и водорослями. Отделять простейших от их живой пищи было утомительно, поэтому Йоахим решил переключиться на другой вид, а именно на родственницу окситрихи эуплотес (Euplotes aediculatus), которая была столь огромна по микробным меркам (почти различима невооруженным глазом), что застревала в марлевом фильтре, когда бактерии и водоросли проходили насквозь. На содержание этих созданий все еще требовалось много времени, поэтому для их разведения мы пригласили студентов Колорадского университета. Студенты выращивали водоросли, чтобы кормить этих инфузорий, проверяли их под микроскопом, убеждаясь, что у них все в порядке, и по мере роста популяции рассаживали их в новые противни для лазаньи.

Но как выделить из этих тварей теломеразу? Йоахим решил выделить РНК-субъединицу теломеразы и использовать ее в качестве «ручки», чтобы вытащить за нее весь фермент. При помощи одного из студентов он смог успешно выделить и секвенировать ген РНК-субъединицы теломеразы эуплотесов[194]. Оказалось, что эта РНК была похожа на РНК тетрахимены, но не идентична ей. Обнаружилось именно то, что мы предполагали: поскольку эти две РНК выполняли одинаковую биологическую задачу, но у разных видов, они адаптировались и изменились в процессе длительной эволюции. Йоахим решил выудить теломеразу во вскрытых клетках эуплотесов, используя в качестве наживки короткий участок ДНК, комплементарный матричному участку в РНК-субъединице. ДНК-наживка должна была связываться с матричной РНК в теломеразе за счет комплементарности, и затем он мог бы вытащить из сложной смеси клеточных веществ эту РНК вместе с присоединенными к ней белка́ми, за которыми он охотился. Это превосходно сработало. Когда биохимикам надо предотвратить разрушение нежных ферментов, они работают в холодной комнате, аналогично тому, как мы храним нашу еду в холодильнике. Год, проведенный в такой холодной комнате, – и Йоахим стал первым, кто сумел выделить из Euplotes aediculatus теломеразу в чистом виде[195].

К сожалению, у нас было очень мало очищенной теломеразы Euplotes, всего около 10 микрограммов. А микрограмм – это одна миллионная доля грамма, и даже грамм – это всего лишь вес одной изюминки. У нас был только один шанс определить последовательность аминокислот этого драгоценного материала, иначе пришлось бы еще на несколько месяцев вернуться в холодную комнату. Поэтому нам нужен был коллега с квалификацией мирового уровня. Весной 1996 г. мы связались с работавшим в Европейской молекулярно-биологической лаборатории в Гейдельберге Маттиасом Манном, который только что изобрел новый метод определения последовательности белков и хотел проверить его на белке с неизвестной структурой. Мы отправили ему нашу уникальную теломеразу, и вскоре он прислал нам 14 фрагментов аминокислотных последовательностей белка теломеразы эуплотес. Для Йоахима этой информации было более чем достаточно, чтобы выделить соответствующий ген.

Для выделения теломеразного белка использовали особенности его РНК-партнера. «Приманкой» была нуклеиновая кислота с последовательностью, комплементарной РНК теломеразы, это позволило отделить РНК со связанным белком (серый овал) от других компонентов клетки

Среди биотехнологических компаний, увлекшихся изучением связи между теломерами и старением, была корпорация Geron (название происходит от того же корня, что и «геронтология»), расположенная в Менло-Парке в Калифорнии. Ее сотрудники упорно работали над выделением человеческой теломеразы из опухолевых клеток, но обнаружили, что это очень сложная задача. И вот в августе 1996 г. они организовали в отеле Hapuna Beach на побережье Кона Большого острова Гавайев четырехдневный симпозиум по теломеразе и раку. Возможно, устроители надеялись, что участники конференции, расслабившись под действием очаровательного места в тропиках и нескольких коктейлей, разболтают какую-нибудь важную информацию об этом неуловимом белке, который в совокупности с РНК образует теломеразу.

На симпозиуме за чашкой кофе я завел разговор со своей старой знакомой Вики Лундблад, которая тогда была профессором Медицинского колледжа Бейлора в Хьюстоне. Вики была одной из моих студенток в те времена, когда я в должности ассистента преподавателя вел лабораторные занятия по общей химии в Калифорнийском университете в Беркли. Позже она стала аспиранткой Джека Шостака, потом постдокторантом у Лиз Блэкберн. Вики хотела постичь фундаментальные механизмы сохранения кончиков хромосом у дрожжей. Любопытно, что она как раз тогда описала два новых дрожжевых гена, при выключении которых теломеры у дрожжей делались всё более короткими. Соответственно, Лиз назвала эти открытые ею гены аббревиатурой Est[196] (от англ. Ever shorter telomeres – «еще более короткие теломеры»).

Дрожжи – одноклеточные организмы. Обычно они бесконечно размножаются, и теломераза их всегда активна. В этом смысле они похожи на человеческие стволовые или опухолевые клетки, которые тоже делятся снова и снова. Результаты, полученные Вики с генами Est, вероятно, можно объяснить тем, что они кодируют критически важные фрагменты теломеразы. В случае инактивации этих генов теломеры дрожжей укорачивались при каждом делении клетки, что приводило к клеточному старению. Последовательность нуклеотидов в генах Est не совпадала ни с чем наблюдаемым ранее, поэтому Вики не понимала, куда двигаться дальше. Я рассказал ей про наши результаты с эуплотесами, и мы подумали, не охотимся ли за одной и той же добычей. Мы говорили об обмене генетическими последовательностями, а тем временем рядом с нами очень медленно наливала себе кофе Тития де Ланге, знаменитая исследовательница теломер из Рокфеллеровского университета. Она предложила нам встретиться – ей было интересно узнать, что из этого выйдет.

Пока мы с Вики были на Гавайях, Йоахим в Боулдере сделал поразительное открытие. Глядя на последовательность аминокислот в новом теломеразном белке эуплотесов, он испытал странное ощущение дежавю. Раньше он уже видел эту последовательность или, по крайней мере, нечто очень на нее похожее в знаменитой обратной транскриптазе – ферменте вируса иммунодефицита человека. Почему наш теломеразный белок похож на важнейший белок такого вируса, как ВИЧ? Чем больше Йоахим об этом размышлял, тем логичнее ему это казалось. Теломераза, как и ВИЧ, должна использовать РНК-матрицу для синтеза ДНК, и обратная транскриптаза обеспечивает этот процесс.

Вернувшись с Гавайев, я связал Йоахима со студентом Вики из Бейлора Тимом Хьюзом. Нашей целью было сравнить генетические последовательности эуплотесов и дрожжей и понять, есть ли смысл дальше работать совместно. И да, смысл был. Белок дрожжей Est2 явно совпадал с нашим белком, выделенным из эуплотесов, особенно в той области, которая была похожа на обратную транскриптазу. Но в отличие от эуплотесов, для которых не существовало никаких молекулярно-генетических инструментов, у дрожжей мы могли подставить несколько версий гена и посмотреть, какие работают, а какие нет.

Началось чрезвычайно интенсивное сотрудничество. Мы сделали дрожжевые гены белка Est2 с мутациями в участке, в котором Йоахим узнал обратную транскриптазу. Помню, как однажды днем я зашел в лабораторию и увидел, что один из моих научных сотрудников держит в руках конверт почты Federal Express, а Йоахим складывает туда пробирки с ДНК. Он отнес пакет вниз, чтобы успеть к последней отправке почтовой службы. Пробирки доставили в Хьюстон для анализа теломер.

Через несколько месяцев все стало ясно. При замене хотя бы одной аминокислоты в той части белка Est2, которая, предположительно, обеспечивала удлинение теломер, происходило укорачивание теломер дрожжей и старение клеток. Они старели бесконтрольно, прямо у нас на глазах. Таким образом, белок Est2, открытый Вики, и, следовательно, наш белок, выделенный из эуплотес, были необходимы для удлинения теломер в живых клетках.

Обнаружить некоторые секретные ингредиенты, предотвращающие процесс старения, было весьма волнующей задачей, но наши открытия, по крайней мере на тот момент, ограничивались дрожжами и прудовым илом. Применимы ли эти знания к людям? Для проверки взаимосвязи между теломеразой, старением и опухолью требовался белок человеческой теломеразы – обязательный партнер той РНК, которую открыли Кэрол и Лиз.

Шли первые годы реализации проекта «Геном человека», когда ежедневно и довольно бессистемно публиковались новые последовательности ДНК. Незадолго до выхода нашей статьи в журнале Science[197] у нас на экране лабораторного компьютера появился неидентифицированный фрагмент последовательности ДНК человека, в значительной степени соответствовавший последовательностям, кодирующим белки теломеразы у эуплотесов и дрожжей. Это был шанс найти белок теломеразы человека. Но как только выйдет наша статья, другие, несомненно, тоже обнаружат это сходство. У нас было всего несколько недель преимущества, чтобы успеть выделить ген человека. Гонка началась!

Одну из групп охотников за геном теломеразы возглавлял известнейший мировой специалист по опухолям биолог Боб Вайнберг из Института Уайтхеда при Массачусетском технологическом институте. Волею судьбы я оказался в совете по научным вопросам Института Уайтхеда. На ежегодном выездном семинаре в Белых горах в Нью-Гэмпшире я разговорился с постдокторантами Вайнберга Крисом Каунтером и Мэттом Мейерсоном возле их стенда и узнал, что они близко подобрались к гену теломеразы человека. Я обронил что-то вроде «Может быть, вам найти другую тему, потому что это мы уже сделали?». Не очень мудро говорить такое двум исключительно талантливым и чрезвычайно амбициозным исследователям, которые сразу же удвоили свои усилия.

В итоге моя лаборатория выиграла ту гонку, но с небольшим отрывом. Наша статья с описанием гена теломеразы человека TERT (от telomerase reverse transcriptase – теломеразная обратная транскриптаза) вышла в Science 15 августа 1997 г.[198] Группа Боба Вайнберга опубликовала прекрасную статью о гене TERT человека[199] на неделю позже. И действительно, при смешивании РНК-субъединицы с белком TERT образовывалась теломераза, работающая и в пробирке, и в живых клетках[200].

Имея в руках оба компонента теломеразы человека, РНК и белок, можно было наконец проверить, действительно ли именно от теломеразы зависит, будут или нет запущены молекулярные часы, ограниченные пределом Хейфлика. Первыми учеными, получившими долгожданный ответ, были профессор Вуди Райт и его коллеги из Юго-Западного медицинского центра Техасского университета в Далласе в сотрудничестве с учеными из корпорации Geron. Они ввели активный ген белка TERT в нормальные клетки сетчатки человека, про которые известно, что РНК-субъединица теломеразы в них уже есть, а белка TERT нет, и теперь клетки могли делиться неограниченно[201]. В то же время клетки сетчатки без TERT прекращали делиться и демонстрировали признаки старения после 50–60-й теломеры – та самая линейка, с помощью которой задается предел Хейфлика, а предотвращает старение активная теломераза. Такой метод теперь используют в биомедицинских исследованиях и промышленности для предотвращения старения культуры человеческих клеток при выращивании в термостатах. Если надо, чтобы клетки человека в вашей культуре неограниченно делились, просто введите ген TERT.

Свойство теломеразы делать клетки человека бессмертными и непрерывно поддерживать в лабораторных условиях их способность к делению без признаков старения – научный факт. Но, к сожалению, из него сделали вывод, что повышение содержания теломеразы может увеличить продолжительность жизни человека. Это некорректное упрощение – думать, что если наши клетки не умрут, то и мы не умрем. Вернемся к моей полке с безделушками, где лежат теломерные кремы, «продлевающие жизнь», и таблетки, «активирующие теломеразу», для которых «клинически доказано удлинение теломер». Поскольку в составе этих таблеток и кремов натуральные растительные компоненты, их можно продавать как биологически активные добавки, не проводя плацебо-контролируемых клинических исследований, которые требует Администрация по контролю за продуктами питания и лекарственными препаратами. То есть на самом деле их эффект не был «клинически доказан».

Однако давайте на минуту представим, что эти таблетки и кремы работают так, как заявлено в рекламе. Что было бы, если бы они действительно не давали нашим теломерам укорачиваться, а клеткам стареть? Это было бы хорошо? Чрезвычайно сложно предположить, что было бы, если бы все наши клетки непрерывно делились. Но мы все-таки попытаемся. Одним из следствий могли бы быть очень крупные люди, которые непрерывно увеличивались бы в размерах. Или, с учетом связи между безостановочным делением клеток и онкологическим процессом, возможно, эти гипотетические люди с теломеразной активностью погибали бы от гигантской опухоли.

Поэтому, чтобы принести пользу, надо аккуратно обращаться с активностью теломеразы и величиной теломер. Если мы когда-нибудь придумаем, как использовать эти исследования на практике, следует предвидеть две ситуации, в которых они могли бы спасти жизни людей.

Первая касается наших стволовых клеток, задача которых – восполнять поврежденные клетки в нашем организме, поэтому они должны продолжать деление на протяжении всей жизни. Изредка рождаются люди с очень короткими теломерами – они меньше, чем у сверстников, на 99 процентов. В результате уже после незначительного укорачивания теломер стволовые клетки таких людей достигают старости и больше не могут поддерживать жизненно важные ткани. Именно в этом причина такого наследственного заболевания, как врожденный дискератоз. У больных наблюдаются аномальная пигментация кожи, деформированные ногти на руках и ногах, поражения полости рта, проблемы с зубами; в дальнейшем многие из них умирают от анемии. Как выяснилось, причиной дискератоза становится мутация в гене какого-либо из компонентов теломеразы, в результате чего клетки, которые должны продолжать делиться, вместо этого стареют. Точно так же многие случаи распространенного заболевания крови – апластической анемии и мучительного заболевания легких – легочного фиброза – возникают из-за недостаточного количества теломеразы и, как следствие, укорочения теломер. Всем этим людям очень бы пригодился безопасный способ удлинить теломеры в их стволовых клетках. Если бы нам удалось создать препарат, который действительно активировал бы теломеразу, следующей задачей было бы нацелить его преимущественно на стволовые клетки.

Вторая ситуация – обратная сторона первой. Большинство опухолевых клеток первоначально были нормальными клетками всего с несколькими роковыми мутациями, из-за которых они начали стремительно делиться. В 90 процентах случаев онкологических заболеваний человека теломераза также активируется – и клетки становятся практически бессмертными. Приведу лишь один пример того, насколько живучи эти опухолевые клетки. Первая линия бессмертных клеток, полученных из опухоли знаменитой онкологической пациентки Генриетты Лакс в Балтиморе в 1951 г., – клетки HeLa. В них активна теломераза, и спустя 70 лет они все еще живы в тысячах лабораторий по всему миру. Подсчитано, что если все когда-либо выращенные клетки HeLa расположить в ряд, то они растянутся более чем на 100 000 километров. Этого достаточно, чтобы трижды обернуть Землю[202].

Учитывая, сколь ужасающую силу приобретают опухолевые клетки благодаря теломеразе, перспективно было бы найти способ не активировать, а подавлять теломеразу в опухолях или вообще изначально предотвратить ее активацию. Но для этого ученым надо было разгадать еще одну загадку: откуда вообще берется в опухолях активная теломераза?

К началу 2000-х гг. ученые во всем мире секвенировали ген TERT в опухолях, но не могли найти мутации, объясняющие, как TERT включается. Так продолжалось до тех пор, пока не появился Франклин Хуанг.

Франклин, сын тайваньских иммигрантов, вырос в Оклахоме. Он получил медицинское образование и защитил диссертацию в Гарвардской медицинской школе, а в 2012 г. как медик начал работать в лаборатории Леви Гаррауэя в Институте исследования рака Даны – Фарбера в Бостоне. Леви использовал для секвенирования опухолевой ДНК новую мощную технологию компании Illumina и был лидером в этой области исследований. Сотрудники его лаборатории искали мутации, которые могли быть причинами развития опухоли и мишенями для фармакологического вмешательства.

Лаборатория располагала обширной коллекцией геномных последовательностей при меланоме, благодаря чему уже была получена полезная информация про этот рак кожи. Однако Франклин взглянул на эти данные под новым ракурсом. Он быстро понял, что в гене TERT происходит нечто необычное. В 17 из 19 образцов меланомы в одной и той же позиции была обнаружена замена одной пары оснований. И этот сбой отмечался не в кодирующем участке, на котором фокусировались все исследователи, а в промоторе – области, запускающей транскрипцию мРНК с ДНК. Было похоже, что при замене нуклеотида возникает участок связывания для транскрипционного фактора – белка, который активирует транскрипцию гена. Возможно, именно из-за этой генетической ошибки начинала синтезироваться теломераза и рак получал простор для развития?

Коллеги Франклина по лаборатории были настроены скептически. Они считали практически невозможным, что одна и та же вызывающая рак мутация возникает с такой высокой частотой. Может быть, это погрешность исследования? Может быть, у высокотехнологичного секвенатора ДНК возникли сложности с этой конкретной последовательностью и он часто прочитывает ее неправильно[203]?

Тогда Франклин определил последовательность ДНК старым методом, без использования высокотехнологичного секвенатора, чтобы избежать его ошибок, если они действительно были. На это ушла вся ночь, но уже на следующий день он получил ответ. У большинства меланомных ДНК-последовательностей действительно была мутация в гене TERT в той самой позиции, где он уже наблюдал ее ранее. Более того, когда он секвенировал ДНК не из опухолевой ткани, а из крови тех же пациентов, то обнаружил, что ни у кого не было этой мутации в гене TERT. Иначе говоря, мутация была характерна именно для раковых клеток, и, следовательно, это было не ошибкой секвенирования ДНК, а реальным фактом.

Затем Франклин и Леви показали, что выявленная однонуклеотидная замена действительно запускает транскрипцию гена TERT. Позже они и другие исследователи обнаружили, что многие типы опухолей тоже используют этот удобный для них прием[204], активируя TERT и таким образом запуская синтез теломеразы, причем с помощью той же самой мутации. Весьма примечательно, что данная мутация независимо возникает постоянно, по всему миру, сотни тысяч раз за год. Вероятно, с такой же частотой возникает и множество других мутаций, но они не приводят к развитию опухоли, а потому остаются незамеченными в дальнейшем.

Открытие, о котором идет речь, очень важно для диагностики. Для многих типов опухолей наличие мутации в промоторе TERT означает более агрессивное течение заболевания[205], и, соответственно, чтобы пациент выжил, требуется более агрессивное лечение. Поэтому проверка на присутствие отмеченной мутации помогает врачам скорректировать план лечения; возможно, если мутация не выявляется в опухоли, будет рекомендовано более мягкое лечение, позволяющее избежать некоторых изнуряющих побочных эффектов химиотерапии.

Уже сейчас информация о мутации помогает пациентам, поскольку ее применяют для диагностики, но хотелось бы использовать ее и для эффективного лечения. Однако тут есть несколько проблем. Одна из них – как подавить активность теломеразы в опухолях и при этом сохранить в стволовых клетках, где она необходима. Как и во всех наших историях, связанных с РНК, знание биологии и понимание генетических механизмов необходимы для медицинского вмешательства, хотя не гарантируют его успешность. Зачастую между научным открытием и его использованием для лечения лежит долгий и сложный путь, и в случае с теломеразой он еще не пройден.

Следующая тема в нашей истории РНК – это РНК-интерференция. Здесь переход от фундаментального открытия к терапевтическому применению произошел значительно быстрее. Отчасти фундаментальные исследования так важны и так интересны, потому что, когда мы узнаём новое о природе РНК, никогда нельзя предугадать, какое этому найдется медицинское применение.

Си Цюнь Сюй орудовал иголкой, ловко перенося крошечных круглых червей из чашки Петри на слой липкого агара, размазанного по предметному стеклу микроскопа. Если бы в июне 1997 г. вы стояли рядом и заглядывали ему через плечо, то усомнились бы, что там можно что-либо забирать и пересаживать: черви были прозрачными[206], тоньше человеческой ресницы и всего миллиметр длиной, так что нужно было обладать острым зрением просто для того, чтобы их хотя бы заметить. Выложив 10 червей в ряд на предметное стекло, Си Цюнь, не отрывавшийся от микроскопа, с помощью ультратонкой стеклянной иглы проткнул кожу первого червя и ввел ему в гонаду (половую железу) мельчайший объем растворенной РНК. Перемещая иглу, он повторил инъекцию каждому из червей. Этот процесс был значительно сложнее, чем вдевание нитки в иголку, но за несколько лет до того, как стать научным сотрудником лаборатории Энди Файера в балтиморском Институте Карнеги, Си Цюнь занимался на родине, в Китае, акупунктурой, и это была подходящая тренировка для выполнения нынешней задачи[207].

С помощью введения РНК Си Цюнь и Энди надеялись решить проблему, которая вызывала недоумение у биологов, занимавшихся червями. Начиная с 1984 г. антисмысловая РНК, с которой мы уже встречались, когда говорили про лечение спинальной мышечной атрофии, стала популярным инструментом для изменения экспрессии генов[208]. Идея заключалась в том, чтобы помешать выработке белка, вводя РНК, которые были комплементарными (антисмысловыми) к мРНК этих белков. Основания из антисмысловой цепочки будут образовывать пары с нужной мРНК, перекрывая кодоны и предотвращая синтез белка. Способность точно выключать гены может быть мощным инструментом, позволяющим выяснять функции разных генов и, может быть, даже деактивировать вредные или мутантные гены.

Но когда антисмысловые РНК стали использовать при работе с популярным экспериментальным организмом – круглым червем Caenorhabditis elegans, это не привело к ожидаемым результатам. Целый ряд биологов, изучавших червей, пытались использовать антисмысловые РНК, и некоторые, в том числе и Энди Файер, заметили нечто странное. В качестве контроля эксперимента исследователи вводили вместо антисмысловой РНК смысловую РНК, то есть полную копию участка с целевой последовательностью мРНК. Не было причин предполагать, что он будет образовывать связи с основаниями из мРНК, потому что С не спаривается с С, А не спаривается с А и т. д. Не было сомнений, что введение смысловой РНК не даст никакого эффекта. Однако ученые с удивлением обнаружили, что смысловая РНК также прерывала экспрессию генов[209]. Трудно было смириться с фактом, что смысловая и антисмысловая последовательности влияют одинаково.

Энди искал путь решения этой загадки. Он проходил стажировку в лаборатории Фила Шарпа в Массачусетском технологическом институте, поэтому был знаком с РНК. Кроме того, он знал, насколько сложно получить чистую смысловую или чистую антисмысловую РНК, поскольку ферменты, используемые в лаборатории для транскрипции РНК с ДНК, иногда в процессе добывания (синтеза) нужной РНК ошибочно вырабатывали и комплементарную цепочку. Возможно ли, что все препараты смысловой и антисмысловой РНК были активны, потому что содержали некоторое количество двуцепочечной РНК?

Энди признал эту гипотезу «несколько притянутой за уши»[210]. Ведь, в сущности, в двуцепочечной РНК нити уже спарены друг с другом, и не означает ли это, что они будут не способны спариваться с чем-то еще и, следовательно, не смогут вмешиваться в работу мРНК? Но черви стоят недорого, а у Си Цюня и Энди уже был опыт инъекций червям, поэтому они решили попробовать. Они очень тщательно очистили смысловые и антисмысловые РНК, чтобы избежать перекрестного загрязнения, а затем одной группе червей ввели смысловую РНК, второй группе – антисмысловую, а третьей – смесь смысловой и антисмысловой в равном количестве, чтобы получить двойную спираль РНК.

Они решили выбрать ген, потеря активности которого была бы хорошо заметна. Ген назывался unc, сокращенно от uncoordinated (нескоординированный), и был необходим для правильного развития нервной системы червя. При мутации или выключении этого гена червь бесконтрольно дергается. Си Цюня и Энди интересовало потомство червей, которым сделали инъекцию, – будет нервная система развиваться правильно или не будет. Удобно, что червей не надо было уговаривать спариваться, потому что они гермафродиты, вырабатывают одновременно яйцеклетки и сперматозоиды и производят внутреннее самооплодотворение.

Через день после введения РНК черви отложили яйца, из которых появилось следующее поколение. Когда Си Цюнь и Энди по очереди заглянули в микроскоп, они увидели нечто захватывающее и неожиданное. Во-первых, лишь потомки червей с введенной двуцепочечной РНК дергались все поголовно как сумасшедшие[211]. Ни смысловая, ни антисмысловая РНК по отдельности не давали такого эффекта[212], действовало только введение двуцепочечной молекулы, поэтому можно предположить, что в предыдущих экспериментах, где смысловая или антисмысловая РНК по отдельности нарушала экспрессию гена у червей, на самом деле происходило загрязнение комплементарными цепочками. Исследователи не только обнаружили, что двуцепочечная РНК может каким-то образом выключать экспрессию генов, по крайней мере у червей, но и показали, что система обладает потрясающей точностью. Двойная спираль РНК воздействовала исключительно на целевой ген unc.

Ученым понадобилось несколько лет, чтобы объяснить эти загадки. Но в тот момент, когда Энди Файер наблюдал извивающихся червей, он смотрел на будущую Нобелевскую премию. Его работа и труды его соавтора Крейга Мелло из онкологического центра Массачусетского университета в Вустере положили начало совершенно новой области молекулярной биологии, получившей название РНК-интерференция.

Вскоре ученые обнаружили, что РНК-интерференция – важный регуляторный процесс в природе, позволяющий организмам снижать активность групп мРНК после того, как они были транскрибированы. Хотя эта система работает у множества животных, от червей до человека, ее заметили, только когда она проявилась в экспериментах Энди Файера и Крейга Мелло с двуцепочечной РНК. Итак, РНК-интерференция еще один поразительный пример биологической роли РНК. Более того, поскольку у больных РНК служит матрицей для синтеза белка, так же как и в здоровом организме, подавление определенных мРНК является новым фармакологическим подходом, поэтому вскоре РНК-интерференцию начали применять и в медицине. Это история про большие перспективы и некоторые трудности, которыми сопровождалось применение РНК. А все началось с непритязательного червячка.

Почему именно червь? Такой выбор организма для экспериментов многим покажется странным, может быть, кто-то даже решит, что это шутка. Но для Сиднея Бреннера все было логично. В 1960-х гг., после того как он помог раскрыть секрет РНК, Сидней занялся другой важнейшей проблемой в биологии – работой нервной системы. Нервная система состоит из головного мозга, спинного мозга и периферических нейронов, связанных со спинным мозгом, в том числе мотонейронов, контролирующих мышцы. Нервная система управляет движением, памятью, принятием решений и поведением.

Чтобы приступить к разгадке ее тайн, Сиднею нужно было выбрать объект для экспериментов. Раньше его любимым организмом была кишечная палочка, но тут она не годилась, поскольку у нее нет мозга. Выбор пал на круглого червя – нематоду C. elegans, так как это давало множество преимуществ. Среди организмов, имеющих мозг, C. elegans[213] – одно из самых простых животных. В организме взрослой нематоды всего около 1000 клеток, из них около 300 – нейроны, клетки нервной системы. Кроме того, эти нематоды прозрачные, а потому клетки разных типов и все их связи легко наблюдать в микроскоп. Наконец, эти черви маленькие: если выложить их одного за другим, чтобы получить цепочку длиной 1 дюйм (2,54 см), понадобится 25 червей. Они начинают размножаться уже в возрасте 3,5 дней, а еще дешевы и просты в содержании.

Сидней был столь харизматичен, умен, обаятелен и общителен, что некоторые наиболее смелые и талантливые молодые ученые того времени двинулись за ним в мир червей. Среди таких последователей были Энди Файер и Крейг Мелло. Энди работал с червями, когда был в постдокторантуре у Сиднея в Кембридже в середине 1980-х гг., а затем он вернулся в США и основал собственную лабораторию в Институте Карнеги. Крейг познакомился с нематодами в 1982 г. в Колорадском университете в Боулдере благодаря моему коллеге Дэвиду Хиршу[214], еще одному из учеников Сиднея.

Благодаря экспериментам с червями исследователи в лабораториях Файера и Мелло обнаружили, что двуцепочечная РНК обладает могущественной способностью вмешиваться в экспрессию генов. Поначалу, однако, не были понятны механизмы этого процесса (как именно двуцепочечная РНК может распознать нужную одноцепочечную РНК) и предстояло выяснить, происходят ли такие явления в естественных условиях.

Ответ на первый вопрос вскоре был получен благодаря новым лабораторным экспериментам в разных концах мира. Ученые описали группу ранее неизвестных (или по крайней мере недооцененных) белков, посредством которых двуцепочечная РНК может заставить замолчать гены. Одним из таких белков был фермент, получивший соответствующее название Dicer («ломтерезка»), который рассекает длинную двуцепочечную РНК на мелкие фрагменты – малые интерферирующие РНК (миРНК). Затем с ними связывается другой фермент и доставляет их к месту действия, его исследователи назвали Argonaute в честь французского пятидесятипушечного линейного корабля 1708 г.

Название показалось подходящим, поскольку белок Argonaute несет мощную артиллерию и, подобно военному кораблю, перемещается в поисках своей цели. В случае с белком цель поисков задается с помощью РНК. Он ищет матричную РНК с последовательностью, комплементарной «ведущей цепи» – одной из цепей миРНК. При загрузке в Argonaute вторая, «пассажирская», цепь миРНК удаляется, оставляя одноцепочечную ведущую цепь открытой для соединения с комплементарными последовательностями целевой мРНК. Затем в бой вступает артиллерия: белок Argonaute – это фермент, способный расщеплять и таким образом инактивировать беспомощную целевую мРНК, которая удерживается на месте за счет связей с основаниями миРНК. Можно сравнить миРНК с системой наведения ракеты, направляющей боеголовку Argonaute к месту атаки.

Вероятно, белки Dicer и Argonaute не плавали внутри червей просто так, ожидая, пока придут исследователи и введут двуцепочечную РНК. У РНК-интерференции должна была быть естественная биологическая функция. Но какая? Оказалось, что ответ уже известен, нужно было просто связать одно с другим. В 1993 г. специалист по биологии развития из Гарварда Виктор Эмброс и генетик из Массачусетской больницы общего профиля Гэри Равкан обнаружили у нематод чрезвычайно мелкие РНК[215], названные микроРНК, которые играют важную роль в эмбриональном развитии организма, выключая выработку определенных белков в нужный момент. Эти микроРНК изначально образовывались в организме в составе более крупных РНК, которые комплементарно соединялись сами с собой, так что получались длинные двуцепочечные участки, подобно тому как складываются плечи при образовании трилистника тРНК. Затем их обрабатывал белок Dicer и они присоединялись к Argonaute, чтобы подавлять активность мРНК, вырабатываемых в организме. Именно поэтому у червей уже был готовый механизм для работы с миРНК, введенными экспериментаторами.

В начале РНК-интерференции длинная двуцепочечная РНК расщепляется клеточным ферментом Dicer, и в результате образуется миРНК длиной 23 нуклеотида, состоящая в основном из спаренных оснований. После связывания с белком ArgonauteР(сокращенно Ago) одна из двух цепей (пассажирская) удаляется, а другая (ведущая) перемещается вместе с Ago и связывается с соответствующими последовательностями мРНК. Затем фермент Ago расщепляет («нарезает на кусочки») мРНК и таким образом инактивирует ее

Природа прошла долгий путь, чтобы создать системы для выработки сложных белков, так зачем ей понадобились микроРНК и РНК-интерференция для разрушения плодов этого нелегкого труда? По мере развития организма из эмбриона до взрослой особи нужно построить различные органы, такие как мозг, кишечник, кожа, репродуктивная система. Клеткам, чтобы разойтись по таким разным путям развития, недостаточно просто начать производство белков новых типов. Они, клетки, должны еще и перестать вырабатывать белки, которые были нужны раньше. Именно такова роль микроРНК в организме: они контролируют трансляцию определенных мРНК.

Каждая микроРНК помогает найти и выключить не одну мРНК, а целую группу совместно работающих мРНК. В результате получается чрезвычайно сложная и запутанная регуляторная сеть. Представим себе, что речь идет не о снижении активности работы генов, а о перекрытии транспортного потока через Ист-Ривер в Нью-Йорке. Движение в Манхэттен и обратно осуществляется с помощью многочисленных мостов, в том числе знаменитого Бруклинского. Аналогично в эмбриональной клетке работает множество генов, активность которых должна быть подавлена, чтобы эта клетка превратилась в клетку мозга. Движение по каждому из мостов может быть замедлено из-за событий, происходящих в Манхэттене: ремонта путей, дорожно-транспортных происшествий или внезапной снежной бури. Влияние таких событий аналогично воздействию микроРНК на активность генов. На движение по каждому из мостов событие повлияет в разной степени, в зависимости от места расположения и других факторов. Влияние будет суммироваться: сочетание заглохшего грузовика и внезапной снежной бури полностью перекроет движение. Точно так же и в случае с РНК-интерференцией: от количества сайтов связывания у микроРНК и распространенности этих конкретных микроРНК зависит, насколько будет подавлен синтез белка с мРНК.

Это были интересные и абсолютно новые сведения, но в конце 1990-х гг. они все еще в основном ограничивались данными, полученными на червях. Чтобы использовать миРНК для выключения генов в медицинских целях, сначала нужно было проверить, применима ли та же самая магия к более сложным организмам, особенно к людям.

Благодаря таланту и целеустремленности Тома Тушля надежды на использование РНК-интерференции в медицинских целях превратились в реальность и спасение жизней. Мы познакомились в 1989 г., когда он, студент из Регенсбургского университета в Баварии, обучался в рамках программы по обмену в моей лаборатории. Он показался мне трудолюбивым и смышленым, но я и предположить не мог, насколько важными окажутся его будущие открытия. В 1999 г. он занимался РНК-интерференцией в лаборатории Фила Шарпа в Массачусетском технологическом институте. Они первыми показали, что миРНК выключает целевую мРНК не каким-то тонким воздействием, а просто разрезая ее на кусочки[216].

Затем Том вернулся в Германию и быстро сделал значимые открытия, заложившие основу для создания лекарств на базе РНК-интерференции. Важно было понять, существуют ли микроРНК у человека. Если они есть, то должны присутствовать и механизмы их использования, в том числе белок-«нарезчик» Argonaute. В таком случае можно было бы попытаться управлять этим механизмом, вводя двуцепочечную РНК, нацеленную на вовлеченную в какое-либо заболевание мРНК. Это было бы мощное новое лекарство.

Однако сначала ученым надо было подтвердить, что микроРНК работают не только в червях. Для этого Том выделил все РНК из самых разных организмов, затем разделил РНК с помощью электрофореза в геле, как это делал Арт Зауг, работая в моей лаборатории с рибозимом тетрахимены. Взяв бритву, он вырезал тот участок геля, где были действительно маленькие РНК, состоящие примерно из 21–23 пар оснований, чтобы отделить их от более крупных – рибосомных, матричных и транспортных РНК. В итоге он обнаружил десятки ранее не замеченных микроРНК[217] из клеток дрозофил, рыб, мышей и, главное, человека. Теперь стало ясно, что природа широко использует РНК-интерференцию для снижения активности генов.

Как же эти микроРНК оставались незамеченными, если еще год назад, в 2000 г., была закончена черновая расшифровка генома человека, а все эти РНК закодированы в нем? В науке все происходит так же, как и в повседневной жизни, когда вы ищете пропавшие ключи от машины под фонарем, потому что там светлее всего. Бóльшая часть энергии ученых была направлена на изучение генов, кодирующих белки, хотя такие белок-кодирующие последовательности составляют лишь 2% от всего человеческого генома[218]. Эти островки, кодирующие белки, были окружены океаном другой ДНК. Поэтому крошечные пятнышки генов микроРНК легко было не заметить.

Со временем у человека описали около 500 различных микроРНК. Было показано, что они участвуют во многих важных процессах, в том числе играют роль в правильном развитии рук и ног, формировании сердечной мышцы, правильном производстве клеток крови, в частности иммунных клеток, в развитии плаценты и протекании беременности[219]. Нарушения в микроРНК приводят к развитию разных заболеваний. Так, опухолевые клетки обычно находят способы уменьшить количество микроРНК, тем самым повысив активность генов, способствующих росту новообразования. Например, одна микроРНК в норме контролирует гены, способствующие делению клеток. В раковых клетках производится меньше этой микроРНК, и потому клетки начинают делиться с нормальной интенсивностью[220].

Если изменения в РНК-интерференции могут приводить к заболеваниям, может быть, удастся использовать ее и для борьбы с болезнями?

В том же году, когда Том Тушль обнаружил микроРНК у человека, он выяснил, что для прекращения работы генов достаточно маленькой двуцепочечной РНК, состоящей из 21 пары оснований или около того. Следовательно, не было необходимости вводить в клетки двуцепочечные молекулы длиной в сотни пар оснований, чтобы Dicer обрезал их до нужного размера, – именно так делали ученые с тех пор, как впервые услышали о работе Энди Файера и Крейга Мелло. Можно было сразу ввести короткую двуцепочечную РНК. Поскольку Том учился в Геттингене у химика Фрица Экштейна, специализировавшегося на нуклеиновых кислотах, он смог получить эти РНК с помощью химического синтеза. Это было важно, потому что, если миРНК можно было синтезировать химическим путем, они становились очень похожими на лекарство. Том заложил научную основу для превращения РНК в лекарственное средство[221], способное воздействовать на мРНК, синтезированную (транскрибированную) с вредоносных генов.

В 2002 г. Том Тушль, Фил Шарп и бывшие коллеги Шарпа по лаборатории Дэйв Бартел и Фил Замор основали компанию Alnylam Pharmaceuticals. Alnylam (Альнилам) – это яркая звезда пояса Ориона, и подобно тому, как Полярная звезда указывает путь на север, эта звезда из созвездия Ориона, надеюсь, укажет компании путь к новому классу лекарственных препаратов.

Чем же так привлекательны миРНК в качестве возможных лекарственных средств? Подумайте о том, что при разработке любого потенциального лекарства необходимо прояснить ряд вопросов. Насколько точно оно бьет по своей мишени, не сильно ли оно затрагивает другие, полезные, процессы? Каковы его побочные эффекты, переносимы ли они? Какова эффективная терапевтическая доза? Как часто его надо принимать? Традиционные лекарственные препараты – небольшие органические молекулы, такие как аспирин, который мы используем как обезболивающее, и аторвастатин (липитор), который мы принимаем, чтобы снизить уровень холестерина. Для проверки безопасности и эффективности таких препаратов требуются долгие дорогостоящие исследования и разработки, которые должны начинаться заново для каждой новой молекулы. Существует большая вероятность, что разработка лекарственного средства потерпит неудачу, что оно не сумеет пройти все положенные испытания. Теоретически для миРНК этот процесс мог бы стать значительно проще. Конечно, в первый раз все это еще сопряжено с многочисленными трудностями: надо стабилизировать миРНК, найти способ ее доставки в соответствующие ткани организма, убедиться в ее безопасности и эффективности. Но если эти проблемы будут решены для одного заболевания, то для борьбы с другим достаточно будет заменить последовательность оснований А, У, Г, С в миРНК, чтобы она соответствовала другой мРНК. Проблемы стабилизации, доставки и безопасности в значительной степени будут решены уже заранее.

Компания Alnylam решила заняться проблемой редких заболеваний; к этой категории относят болезни, встречающиеся менее чем у 200 000 человек в США. Такие расстройства еще называют орфанными[222] заболеваниями, поскольку количество пациентов с каждым из этих недугов слишком мало, чтобы фармацевтическим компаниям было выгодно тратить миллиарды долларов на разработку лекарств и проведение клинических испытаний на людях. Однако в совокупности от орфанных заболеваний страдает огромное количество людей, а их потребности в медицинской помощи остаются не удовлетворены. Установлено, что более 3000 наследственных заболеваний вызваны мутацией в единственном гене[223] и в одних только Соединенных Штатах от таких расстройств страдает более 25 млн человек. Если создавать 3000 разных лекарств для 3000 орфанных заболеваний невыгодно, может быть, разработать одно миРНК-лекарство, а затем настроить его последовательность на 3000 разных мишеней? И помочь всем, кто остался в одиночестве со своим редким заболеванием?

Первая проблема, которую надо было решить команде Alnylam, чтобы превратить миРНК в эффективное средство лечения, заключалась в том, как доставить ее к пораженным клеткам. РНК сама по себе слишком нестабильна, чтобы быть хорошим лекарством; она легко разрушается рибонуклеазами, которые в изобилии присутствуют во всех тканях человека, поскольку они разрушают РНК, содержащуюся в пище, которую мы едим, или помогают клеткам менять набор экспрессирующихся генов. Кроме того, РНК не может пройти сквозь защитный мембранный слой, ограждающий клетки от незваных гостей. Поэтому ученые из Alnylam позаимствовали трюк, который постоянно используют РНК-вирусы: они завернули РНК в оболочку из липидов, которая сливается с клеточной мембраной человека таким образом, что РНК заходит внутрь клетки. Эта же оболочка защищает РНК от рибонуклеаз.

Первые клинические испытания миРНК в оболочке Alnylam провела для заболевания под названием «наследственный ATTR» или «транстиретиновый (TTR) наследственный амилоидоз». Белок TTR вырабатывается в печени и в норме выполняет роль переносчика, помогая поддерживать нормальный уровень гормонов щитовидной железы, витамина А и других веществ[224]. Но при заболевании иногда важно не чем должен заниматься нормальный белок, а как ведет себя мутантная форма. Передающиеся по наследству мутации в гене TTR приводят к тому, что белок TTR сворачивается неправильно и в виде фибрилл – тонких нитевидных структур – накапливается в нервах и в сердце. Большинство из нас никогда не слышало о такой болезни, потому что она редкая: в мире существует всего около 50 000 людей с этим заболеванием. Но для этих 50 000 их состояние – катастрофа: они страдают от сердечно-сосудистых и неврологических проблем и часто не могут ходить. Смерть обычно наступает примерно через десять лет после изначальной постановки диагноза.

Препарат миРНК компании Alnylam накапливается в печени, где производится мРНК белка TTR, и не дает образовываться мутантному TTR белку[225]. В 2018 г. клинические исследования миРНК были завершены и принесли хорошие новости: состояние больных с ATTR, получавших лекарство, стабилизировалось, они даже стали лучше ходить, тогда как состояние больных из контрольной группы, получавших плацебо, продолжало ухудшаться[226].

Однако при разработке лекарств часто бывает так, что вы решаете одну проблему, а на ее месте возникает другая. В случае с миРНК-препаратами лекарство в виде наночастиц надо было вводить внутривенно ежемесячно, для этого пациентам нужно было приходить в больницу или в специальный медицинский центр и сидеть там в течение часа, пока препарат медленно поступал из капельницы через иглу в руке. Это было дорого, утомительно и часто болезненно для пациента. Чтобы избежать внутривенного введения, ученые из Alnylam нашли способ введения миРНК с помощью подкожных инъекций, добавив кое-что к двуцепочечной РНК. Они сделали своеобразную «ручку», которая цепляется за рецептор на поверхности клеток печени. Хотя этот прием работал только для клеток печени, теперь можно было вводить миРНК простым уколом в плечо, как при вакцинации, без использования капельницы.

Как и надеялись ученые из Alnylam, успешная разработка миРНК-лечения для ATTR значительно облегчила разработку лекарств для борьбы с другими заболеваниями. В 2018–2023 гг. Администрация по контролю за продуктами питания и лекарственными препаратами одобрила предложенное Alnylam лечение еще для четырех редких и очень тяжелых заболеваний печени. Если на разработку первого препарата понадобилось 16 лет, то на следующие в среднем уходит по одному году. Но поскольку моногенных заболеваний около 3000, предстоит еще долгая работа.

Компания Alnylam доказала возможность использовать миРНК для лечения редких наследственных заболеваний. А как насчет тяжелых болезней, встречающихся гораздо чаще? По мере развития медицины все меньше людей умирает от инфекционных заболеваний. Даже смертность от онкологических заболеваний снижается: в период 2001–2020 гг. смертность от них в США сократилась более чем на четверть, с 197 до 144 смертных случаев на 100 000 человек в год[227]. Но поскольку люди живут всё дольше, у них чаще возникают такие ужасные нейродегенеративные расстройства, как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона[228] или боковой амиотрофический склероз (БАС). Уровень смертности от болезней Альцгеймера и Паркинсона стремительно вырос: более чем в два раза за те же 20 лет, когда снижалась смертность от рака[229], и смертность от БАС тоже растет[230]. Эти заболевания не только наносят ущерб здоровью людей, они разрушают семьи, принося страх и горе, когда близкий человек меняется до неузнаваемости.

РНК непосредственно связана со всеми этими недугами. Так может ли какая-либо разновидность технологии миРНК использоваться и для борьбы с всплеском нейродегенеративных заболеваний? Рассмотрим, например, БАС, который называют также болезнью Лу Герига, в честь бейсболиста, страдавшего от нее. БАС особенно разрушителен, поскольку проявляется внезапно у здоровых, казалось бы, людей, а затем быстро прогрессирует, поражая двигательные нейроны. Я дважды был свидетелем того, как эта болезнь поражала людей из числа моих друзей и коллег. Эти люди находились на пике своей продуктивности, а затем неуклонно теряли способность есть, говорить, ходить и, наконец, дышать. В одном случае паралич и смерть наступили через пять лет после появления симптомов, а в другом – через год.

Хотя часто БАС возникает спорадически, то есть при отсутствии этого заболевания в семейном анамнезе, бывают также наследственные случаи. Такие семейные истории болезни особенно интересны ученым, занимающимся биологической медициной, поскольку возникает возможность выявить генетические причины заболевания. Наиболее распространенная генетическая причина БАС связана с геном, обозначаемым в духе технической документации, – C9orf72[231]. Обычно этот ген содержит несколько повторов определенной последовательности нуклеотидов: ГГГГЦЦ. Но при БАС ошибки в репликации ДНК приводят к существенному увеличению количества повторов, так что ген содержит тысячи копий одной и той же последовательности ГГГГЦЦ. Когда эта ненормальная ДНК затем транскрибируется, в РНК повторы сохраняются. Ученые до сих пор продолжают выяснять все те последствия, которые возникают из-за такой неправильной РНК. Основная проблема, видимо, связана с тем, что эта ненормальная РНК привлекает и удерживает белки (в том числе белок под обозначением hnRNP H), необходимые для правильного сплайсинга РНК. Когда к повторам РНК прилипает так много белков, нужных для сплайсинга РНК, им сложно выполнять свою обычную работу – и нарушается альтернативный сплайсинг, который должен происходить в нейронах[232]. В итоге нейроны погибают и организм больного теряет способность передавать сигналы от центральной нервной системы к периферическим мышцам.

Может быть, с помощью РНК-интерференции ученые когда-нибудь смогут разрушать патогенную РНК, способствующую развитию БАС, и остановят прогрессирование заболевания или даже предотвратят его возникновение? Пока это просто теоретические рассуждения. Например, доставка миРНК в моторные нейроны может оказаться гораздо сложнее, чем в печень. К такому органу, как печень, можно добраться, введя лекарство в кровоток. А вот добраться до мозга – более сложная задача. Это связано с наличием естественной защитной системы – гематоэнцефалического барьера, стены из плотно расположенных клеток, которая сформировалась в процессе эволюции, чтобы не допустить в мозг ядовитые вещества и другие вредные элементы. Такой барьер отфильтрует любое лекарство на основе РНК, прежде чем оно проникнет в мозг, следовательно, его придется доставлять туда другим способом, например вводя в спинномозговую жидкость, а это инвазивная и дорогостоящая процедура. Кроме того, поскольку разрушение патогенной РНК не восстановит нормальную работу гена, лечение с помощью миРНК может оказаться неэффективным. Однако, учитывая научную перспективность этого метода и возрастающую потребность в лечении упомянутых заболеваний, исследователи не отказываются от идеи направить терапию миРНК на мозг. В борьбе с БАС и другими нейродегенеративными заболеваниями надо использовать все возможные средства.

Сопровождающаяся деменцией болезнь Альцгеймера – другое ужасное нейродегенеративное заболевание, которое можно было бы лечить с помощью миРНК. В 2021 г. только в США более 6 млн человек жили с болезнью Альцгеймера, и, поскольку население стареет, количество таких больных ежегодно растет. В мозге у них образуются два типа белковых скоплений – амилоидные бляшки и клубки тау-белка; считается, что они препятствуют нормальной работе нейронов. В первом случае белок, который называется предшественником бета-амилоида, расщепляется ферментами мозга и в результате образуется побочный продукт – пептид бета-амилоид. Этот материал накапливается между нейронами, подобно налету между зубами. Во втором случае тау-белок накапливается не вокруг нейронов, а внутри, образуя клубки, из-за которых нарушается работа рецепторов. Как и все человеческие белки, предшественник бета-амилоида и тау-белок кодируются мРНК, которая управляет их синтезом. Поэтому кажется правдоподобным, что введение миРНК, которая запускала бы разрезание одной из этих мРНК или даже обеих, позволило бы уменьшить количество соответствующих белков и могло бы оказывать лечебное действие.

В 2022 г. компания Alnylam объявила о новой программе по борьбе с болезнью Альцгеймера в сотрудничестве с биотехнологической компанией Regeneron, получившей известность благодаря своему препарату с антителами против COVID–19. В частности, эти компании совместно разрабатывают миРНК, направленные на мРНК белка – предшественника амилоида. Ученые ожидают, что уменьшение количества этого белка соответствующим образом приведет к замедлению образования бета-амилоидных бляшек. «Ручку», которая была приделана к миРНК и нацелена на печень, заменили на новую, и с помощью полученного препарата удалось эффективно и безопасно снизить выработку белка – предшественника амилоида в центральной нервной системе у мышей[233].

От демонстрации эффективности терапии на мышах до создания эффективного лечения для людей лежит долгий путь с многочисленными препятствиями, но нам всем надо надеяться на лучшее. В конце концов, ставки очень высоки: это возможность обратить вспять нейродегенеративное заболевание, которое на сегодняшний день представляет собой, пожалуй, самую сложную и актуальную медицинскую проблему человечества.

От экспериментов на скромнейших червячках мы пришли к лечению с помощью миРНК. Это, конечно, замечательная история, но, к счастью, она вовсе не уникальна. Самые большие прорывы в биомедицине почти всегда совершаются на основе фундаментальных исследований, которые выполнялись с целью понять, как устроена природа, а не ради каких-либо медицинских целей. Энди Файер и Крейг Мелло хотели изучать гены, контролирующие поведение крошечного прозрачного червя, предполагая, что механизм, работающий у червя, будет применим и к другим многоклеточным организмам, в том числе к людям. Они хотели усовершенствовать набор инструментов, помогающих остановить производство определенных белков, и антисмысловые РНК показались им перспективными. Они творчески подошли к планированию экспериментов, и к тому же им здорово повезло: в итоге они обнаружили, что выигрышной оказывается не одноцепочечный, а двуцепочечный вариант РНК. Это потрясающее открытие распахнуло дверь в совершенно новую область исследований: оказалось, что микроРНК регулируют генетические системы во всех сложных организмах, в том числе у людей, и так появился принципиально новый тип лекарств.

Теперь мы немного понимаем, какой вред может нанести РНК, если она работает неправильно. Но вызывают беспокойство не только хорошие РНК, которые испортились, вроде тех, что способствуют возникновению и развитию нейродегенеративных заболеваний. Некоторые РНК изначально плохие, по крайней мере с нашей точки зрения. Как мы скоро узнаем, многие вирусы, вызывающие масштабные пандемии, работают полностью за счет РНК. Но хотя у РНК есть темная сторона, если понять, как она работает, можно бороться с ней, используя ее собственные уловки.

Шел 1935 год, биохимик Уэнделл Стэнли следил за всходами турецкого табака в теплице Рокфеллеровского института медицинских исследований в Принстоне (штат Нью-Джерси). Когда ростки достигли высоты в три дюйма, он взял марлевую салфетку, обмакнул ее в препарат вируса табачной мозаики и начал втирать его в листья. Этот вирус был погибелью для всей табачной промышленности. Он оставлял на пораженных листьях мозаично расположенные пятна. В XIX в. ученые обнаружили, что некоторые патогены слишком малы и проникают через фильтры, задерживающие бактерии. Впоследствии эти патогены получили название «вирусы». Спустя сорок лет исследователи все еще не знали, как вирусы устроены, не говоря уже о том, как они вызывают заболевания. Этот пробел в знаниях и собирался заполнить Стэнли.

Через три недели после того, как он нанес вирус табачной мозаики на листья, болезнь развернулась в полную силу. Он срезал листья, заморозил их и в таком виде пропустил через мясорубку – не очень сложное, но эффективное научное оборудование. Дав полученной массе оттаять, Стэнли отжал сок, в котором находилось то, что его интересовало, – вирусные частицы[234]. Он мог рассмотреть их в электронный микроскоп: красивые маленькие палочки, короче и намного тоньше, чем клетка бактерии кишечной палочки. Не удивительно, что вирусы могли проходить через фильтры, которые задерживали бактерии.

Раствор вируса табачной мозаики у Стэнли был настолько концентрированный, что он смог кристаллизовать вирусные частицы[235]. Как мы знаем на примере Джеймса Самнера и его кристаллов белка уреазы, кристаллизация – надежный способ получить вещество в чистом виде. Кристалл содержит только нужные молекулы, а все примеси остаются снаружи. Когда Стэнли проанализировал закристаллизованный вирус, то оказалось, что там был чистый или почти чистый белок. Такой кристалл на 94% состоял из белка, но в нем были и досадные 6% РНК.

Открытие Стэнли было признано важным. У вируса, обладающего такими свойствами живого, как размножение и способность к мутациям, оказался простой белковый химический состав. Когда Стэнли читал свою лекцию по случаю получения Нобелевской премии по химии в 1946 г.[236], РНК была в ней лишь мельком отмечена, а всю славу своего открытия он отдал белкам. Однако в последующие десятилетия значение бегло упомянутой им РНК все увеличивалось. Пусть Стэнли считал ее несущественной деталью, сегодня она стала главной для понимания вирусов и борьбы со многими наиболее опасными из них.

Вирусы неизбежны. Какую бы организованную биологическую систему мы ни взяли – клетку, организм, сообщество, обязательно найдутся существа, которые будут использовать эту систему в своих интересах, ничего не отдавая взамен. Мы называем их паразитами. Они неизбежны, потому что быть паразитом намного проще и легче, чем полноценным организмом. Паразитов порождают те же самые химические принципы и условия окружающей среды, что порождают и все живое.

Поскольку вирусы вездесущи, их количество на Земле огромно: 10³¹, что в 10 млрд раз больше, чем звезд в известной части Вселенной[237]. К счастью для нас, большинство этих вирусов – фаги, которые заражают только бактерии. Их разнообразие столь велико, что когда студенты в рамках нашего курса по молекулярной биологии в Боулдере очищают бактериофаги, найденные в почве, на городской свалке или под клеткой льва в зоопарке, то всякий фаг неизбежно оказывается неизвестным ранее видом.

Каждый вирус должен себя воспроизводить. Каждому вирусу необходим набор генов для реализации своего инфекционного цикла. Чтобы раскрыть тайну вирусов, Стэнли и другим исследователям нужно было ответить на вопрос, как хранится эта наследственная информация. Действительно ли она спрятана в белках? Стэнли получил Нобелевскую премию в 1946 г., через два года после того, как Освальд Эвери из Рокфеллеровского института в Нью-Йорке объявил, что ДНК – это «трансформирующее начало»[238] и что именно из нее состоят гены бактерии, вызывающей пневмонию. Однако все еще сохранялись представления, что наследственная информация может находиться не в нуклеиновых кислотах, а в более сложных по своему строению белках. В своей нобелевской лекции Стэнли уклонился от этой темы. Он так и не выбрал, на что сделать ставку в вопросе о химической природе наследственного вещества у вирусов. Было ли оно белком, который, очевидно, составлял основную часть вируса (и Стэнли именно за него получил Нобелевскую премию)? Или, может быть, это было небольшое количество нуклеиновой кислоты?

В любом случае Стэнли недооценил РНК, а как мы теперь знаем, никогда не следует недооценивать РНК. Но когда в 1948 г. он перебрался в Калифорнийский университет в Беркли и набрал там команду для своей новой лаборатории по изучению вирусов, он взял на работу специального сотрудника, чтобы тот уделил РНК должное внимание.

Путь Хайнца Френкель-Конрада в Беркли был извилистым. Он родился в старинном городе Бреслау[239], находящемся на территории современной Польши, и в 1933 г. получил там диплом медика. Увидев, как в Германии набирает силу нацизм, он разумно перебрался в Эдинбург, где защитил докторскую диссертацию, после чего эмигрировал в Соединенные Штаты. Его шурин, биохимик Карл Слотта, переехал из Польши в Сан-Паулу, где продолжал работу над открытым им гормоном прогестероном, что впоследствии привело к созданию противозачаточных таблеток. Френкель-Конрад навестил Слотту в Бразилии, где и остался. Затем они изучали яд южноамериканской гремучей змеи и использовали его для выделения первого нейротоксина. В 1952 г. Стэнли пригласил Френкель-Конрада в Беркли на работу в свою новую лабораторию.

В Беркли Френкель-Конрад заинтересовался тем небольшим количеством РНК, которое было в вирусе табачной мозаики (ВТМ). Он опирался на открытие двух немецких ученых, которые в 1956 г. показали, что очищенная РНК ВТМ, нанесенная на листья табака, сама по себе вызывает заболевание у растения[240]. По-видимому, никаких белков для этого не требовалось, достаточно было поцарапать листья, чтобы РНК могла попасть внутрь. Это были действительно убедительные данные, показывающие, что РНК является наследственным веществом ВТМ, хотя, возможно, какое-то неопределяемое количество вирусных белков попало в лист вместе с РНК и вызвало заболевание.

Чтобы тщательно проверить, действительно ли РНК – наследственное вещество ВТМ, Френкель-Конрад выделил РНК из такого штамма ВТМ, который вызывал только мелкие пятна на листьях, а не заражал весь организм. Затем он объединил эту РНК с белками полностью рабочего вируса. Полученные частицы он втирал в листья, в результате чего развивалась инфекция с мелкими пятнами. В то же время когда он собирал другую смесь из РНК полноценного вируса и белков штамма, вызывающего мелкие пятна, то выигрывал полноценный вирус. Не белками, а именно РНК, таким образом, определялась форма заболевания, и это однозначно свидетельствовало, что РНК – генетический материал вируса[241].

Существуют две главные разновидности вирусов. Некоторые вирусы, как, например, те, которые вызывают ветрянку или оспу, хранят свою генетическую информацию в форме ДНК, так же как растения, животные и все остальные живые организмы на Земле. Но у многих самых опасных вирусов гены состоят из РНК, а ДНК у них и вовсе нет. Эти РНК-вирусы не только поражают растения, как вирус табачной мозаики, но и вызывают болезни у людей, в частности грипп, корь, свинку, полиомиелит, лихорадку Зика, лихорадку Эболы, COVID–19 и многие другие. Эти вирусы могут обходиться без ДНК. А вот обратные примеры не встречаются, ДНК-вирусы все равно используют РНК. ДНК-вирусы, как и более сложно устроенные организмы, транскрибируют мРНК с ДНК, которая уже кодирует строение вирусных белков. Поэтому РНК необходима всем вирусам.

Насколько РНК-вирусы древние? Мы уже поняли, что первые самовоспроизводящиеся системы на Земле могли состоять из РНК, потому что она способна быть одновременно информационной молекулой и биологическим катализатором, который и копирует эту информацию. Эта гипотеза происхождения жизни называется РНК-миром. Могу поспорить, что на следующий день после появления первых самореплицирующихся РНК к ним уже присоединился за компанию небольшой кусочек паразитической РНК, который не приносил никакой пользы для системы. И каждый раз, когда на планете появлялся новый организм, у него вскоре появлялись собственные вирусы. Более того, вирусы могут мутировать и менять своих хозяев, например переходить к человеку от животных, вызванные такой мутацией болезни называют зоонозами. Поэтому наготове всегда есть огромный резервуар потенциально новых вирусов.

В течение миллионов лет эволюции все РНК-вирусы преодолевали одни и те же проблемы: как проникнуть в клетку хозяина, как синтезировать необходимые белки, как скопировать свои РНК-геномы и как упаковать их, чтобы получить патогенных потомков. Каждый вирус решал эти задачи по-своему. Например, вирус SARS-CoV–2 выработал свой уникальный белок шипа, который соединяется с рецептором ACE2 на поверхности клеток вашей носоглотки и легких, наподобие того как вилка входит в розетку. Как только вирус закрепился на поверхности клетки, ему нужно проскользнуть сквозь клеточную защиту. Это несложно. Ведь и вирус, и клетка покрыты сходной липидной оболочкой, поэтому они могут просто слиться друг с другом. Это похоже на поверхность куриного супа в миске. Там плавают плоские островки жира, окруженные бульоном, и когда два таких островка соприкасаются, они соединяются в один большой жировой остров. Так вирус оказывается внутри клетки и может делать все, что захочет.

И все-таки как именно РНК-вирус копирует свой РНК-геном? Ну, это бывает по-разному. Есть два основных класса РНК-вирусов: вирусы, содержащие положительную (+) нить, например SARS-CoV–2, и вирусы, содержащие отрицательную (–) нить, например вирус гриппа. (+) РНК-вирусы при репликации сначала делают комплементарную (–) РНК, по которой в дальнейшем синтезируют множество более опасных (+) нитей РНК. Представьте опять, как вы делаете гипсовую отливку садового гнома: сначала надо подготовить форму, которая будет инвертированной копией вашего гнома, а затем залить в нее гипс и сделать столько копий гнома, сколько вам нужно. Это верно и для (+) РНК-нитей: как только вы сделали комплементарную (–) нить, ее можно использовать снова и снова для изготовления (+) РНК-нитей. Другая важная особенность (+) РНК-вирусов заключается в том, что вирусная РНК, которая попадает в клетку, может использоваться как матричная РНК. Как только такая мРНК проникает в цитоплазму клетки человека, она находит хозяйские рибосомы, которые, не подозревая, что делают что-то не то, начинают синтезировать белки, необходимые вирусу для его жизненного цикла. Среди прочих белков образуется вирусная РНК-полимераза, которая реплицирует вирусную РНК. А также там есть белок капсида и белок шипа, которые покрывают новые вирусные частицы, делая их способными заражать другие клетки.

Вирус табачной мозаики тоже входит в клуб положительных РНК-вирусов. Другие (+) РНК-вирусы, заражающие клетки человека, – вирус полиомиелита, вирус лихорадки денге, вирусы гепатитов A и C, а также риновирус, вызывающий обычную простуду. Краснуха, или немецкая корь, тоже вызывается (+) РНК-вирусом. Эта болезнь была одной из самых распространенных у детей, но потом практически везде ее успешно победили с помощью вакцины против кори, паротита, краснухи (MMR).

(–) РНК-вирусы, напротив, проникают в клетку не в виде мРНК, на которой закодированы белки, а в виде ее комплементарной копии. Иначе говоря, у вас есть не гном, а форма для отливки гнома. Эти вирусы приносят с собой собственные ферменты для копирования и, как только они попадают в клетку, сразу начинают копировать (–) РНК на (+) РНК, которая будет служить мРНК. Такие вирусные мРНК опять же захватывают хозяйские рибосомы, чтобы производить свои опасные белки. К (–) РНК-вирусам относятся все вирусы гриппа, а еще респираторно-синцитиальный вирус, вирусы бешенства и лихорадки Эбола. Вирусы паротита и кори тоже попадают в эту группу, так что вакцина MMR защищает от двух (–) РНК-вирусов и одного (+) РНК-вируса.

Сколько белков закодировано в вирусной РНК? Их число варьирует, но, как правило, их не очень много. Вирусы невероятно эффективные паразиты: они сами делают лишь малую часть всей работы, заставляя хозяйскую клетку обеспечивать им основную часть их цикла. Особенно эффективный вирус – ВТМ: его РНК содержит всего 6300 оснований, и они кодируют четыре белка, из которых два нужны для репликации РНК, один облегчает передачу между клетками растения и один формирует цилиндрическую оболочку (капсид), удерживающую РНК в своей центральной полости. В геномах вируса полиомиелита и вируса гриппа закодировано 10 и 17 белков соответственно. SARS-CoV–2 – настоящий монстр (во всех смыслах), в его геноме закодировано 29 белков[242]. Хотя для вируса это огромное количество, по меркам живых организмов оно очень мало. Геном кишечной палочки, например, содержит около 4000 белок-кодирующих генов, а у человека их около 20 000.

Мои дочери то и дело пишут мне текстовые сообщения, и быстрые движения пальцами нередко приводят к ошибкам: «Спасибо за беду», а через несколько секунд поправка «беду = еду», или «Детей надо вырыть в три часа», а потом «*вымыть». Иногда текст содержит несколько опечаток в ключевых местах, и тогда я совсем не понимаю, о чем речь.

То же самое происходит и при репликации вирусной РНК. Несколько ошибок могут быть незаметны или даже полезны, но когда их становится слишком много, то вирусу не выжить. Полимеразы, которые копируют РНК, совершают примерно одну ошибку на 10 000 оснований. Может показаться, что это не очень серьезно, ведь мы в повседневных делах допускаем погрешности чаще, чем один раз на 10 000. Однако именно вирусный геном содержит около 10 000 оснований, а это значит, что при такой частоте ошибок в каждой репликации РНК где-то будет неточность. Большинство этих «опечаток» связано с заменой оснований (например, А появится вместо Г), что часто приводит к изменениям в какой-либо аминокислоте одного из вирусных белков. Такие изменения могут быть нейтральными, или помешают вирусу заниматься своими делами, или же улучшат приспособленность вируса, если, например, позволят надежнее связываться с хозяйской клеткой, быстрее копировать геном, сопротивляться противовирусным препаратам либо уворачиваться от антител.

Не отступающий перед сложностями исследователь из Иллинойсского университета Сол Шпигельман одним из первых показал, как вирусы извлекают выгоду из собственных ошибок. Он внес свежие веяния в довольно консервативную временами научную область и для придания живости сказанному использовал в научной статье слово «библейская», что не характерно для сухих публикаций по биохимии. В 1961 г. Шпигельман заинтересовался вопросом, как РНК-бактериофаги реплицируют свой геном, когда проникают в бактерию. Эта репликация необходима для выживания вируса, но в то время у исследователей были лишь смутные представления, как именно она работает.

Чтобы ответить на вопрос, Шпигельману необходимо было получить РНК-полимеразу бактериофага – фермент, с помощью которого вирус копирует себя. Ученый обнаружил, что бактериофаг Q-бета производит функциональную стабильную полимеразу, которую легко выделить. Q-бета – это (+) РНК-вирус, и Шпигельман заметил, что в пробирке полимераза использует РНК-вируса как матрицу, образуя ее комплементарную копию, с которой, в свою очередь, безостановочно синтезирует множество фаговых РНК. С положительной цепочки делается отрицательная копия, а с той – снова положительная.

В ходе своих хорошо продуманных экспериментов Шпигельман сделал смелый шаг: он отказался от бактерии и даже от самого вируса. А просто смешивал в пробирке РНК бактериофага Q-бета и его полимеразу, после чего примерно сутки наблюдал, как РНК удваивается и эволюционирует в лабораторных условиях. Его исследования помогли нам понять, каким образом ошибки в репликации приводят к появлению вариаций вируса с новыми способностями.

«Что произойдет с молекулами РНК, если единственным требованием к ним будет библейская заповедь – размножайтесь, но с биологическим условием: делать это как можно быстрее?»[243] Задавшись этим вопросом, Шпигельман провел эволюционный эксперимент с «последовательным переносом». Он установил ряд пробирок, в каждой из которых был простой раствор солей с РНК-нуклеотидами – строительными элементами для репликации РНК. Затем в первую пробирку он добавил каплю, содержащую РНК бактериофага Q-бета и его полимеразу. Спустя 20 минут пробирка заполнилась свежесинтезированными молекулами РНК. Шпигельман взял оттуда одну каплю и «засеял» ее содержимым вторую пробирку. После нескольких раундов, в которых он давал на репликацию 20 минут, Шпигельман повысил ставки – сократил время между переносами до 15, затем до 10 и, наконец, до 5 минут. Таким образом он оказывал давление на свою систему, чтобы каждый раз выигрывали быстро удваивающиеся молекулы, которые в итоге и распространились в этой популяции.

После целого дня такой эволюции Шпигельман посмотрел, что оказалось в последней пробирке. Его изначальная цепочка вирусной РНК, состоявшая из 3300 нуклеотидов, уменьшилась до «маленького монстра»[244] всего из нескольких сотен нуклеотидов. Он понял, что полимераза бактериофага Q-бета совершает ошибки, иногда перескакивая через участки матрицы РНК. В ситуации, когда быстрая репликация подкрепляется, меньшее количество оснований дает селективное преимущество, и «маленький монстр» выигрывает соревнования.

Шпигельман проверил и другие варианты давления отбора. Когда он добавил небольшое количество рибонуклеазы к реплицирующейся РНК вируса, то бо́льшая часть РНК, как и ожидалось, была разрушена и в итоге исчезла. РНК действительно ненавидит рибонуклеазу. Однако некоторые молекулы РНК, имеющие мутации в тех местах, с которыми предпочитает связываться рибонуклеаза, оказались в какой-то степени защищены. После нескольких раундов репликации возникал мутант, устойчивый к рибонуклеазе, который благополучно реплицировался в ее присутствии[245].

Эволюция этого бактериофага напоминает то, что мы наблюдали недавно с РНК-вирусом SARS-CoV–2. По мере того как SARS-CoV–2 распространялся среди населения Земли, он мутировал несчетное количество раз, и некоторые из этих мутаций, как оказалось, давали ему преимущества. Возьмем вариант «Омикрон», о котором сообщила Всемирная организация здравоохранения в 2021 г., почти через два года после того, как был описан первый случай COVID–19. У «Омикрона» в гене белка, который кодировал «шип», было выявлено 35 мутаций по сравнению с изначальным уханьским штаммом вируса, и каждая из этих мутаций меняла одну аминокислоту. Эти измененные аминокислоты располагались на той части белка, которая присоединяется к рецептору на поверхности клетки. Они улучшали способность шиповидного белка связываться с поверхностью клетки, и, предположительно, именно поэтому «Омикрон» оказался намного более заразным, чем ранние варианты[246]. Мало того, мутации позволили вирусу лучше сопротивляться антителам, которые были выработаны против предыдущей версии шиповидного белка, что сделало лечение антителами и вакцинацию менее эффективными[247].

И дело не том, что вирус пытается ускользнуть от антител. Репликаза совершает ошибки, и, таким образом, новые варианты вируса непреднамеренно и постоянно проходят проверку. Те мутанты, которым повезло избежать иммунного ответа человека, способны жить долго и процветать.

Космонавты летают по орбите, запертые в капсуле космического корабля, которая выполняет две важные функции: защищает их от опасности открытого космоса и обеспечивает возвращение на Землю после завершения миссии. Вирусная РНК, как и космонавты, не может перемещаться без защиты, она должна быть заключена в оболочку – капсид. Именно капсид защищает РНК от таких опасностей внутри человека, как рибонуклеазы, а также направляет РНК вируса в нужную клетку. Наличие капсида настолько важно, что РНК использует часть своего небольшого генома, чтобы закодировать белок или белки, которые будут объединяться с РНК и образовывать капсид.

Как показали эксперименты Сола Шпигельмана, вирусы находятся под давлением отбора, которое сохраняет их геном маленьким для быстрой репликации, поэтому каждый ген в нем буквально на вес золота. По этой причине вирусы создают свой капсид из строительных белков, отличающихся минимально возможным разнообразием. У ВТМ капсид состоит из белков только одного типа, причем каждая молекула соединяется с соседней впереди и с соседней позади. Эти белки, связываясь, образуют изогнутую конструкцию, которая в итоге сворачивается в цилиндрическую трубку, в центре которой полость, где располагается РНК. Образование такой конструкции напоминает постройку стены из одинаковых клиновидных деталей конструктора Лего. Если их соединять вместе, то стена будет сворачиваться, образуя трубку.

У бактериофага Q-бета капсид совсем другой по форме. Древние греки изучали геометрию и описали платоновы тела – трехмерные фигуры, составленные из правильных многоугольников. Одна из таких фигур – икосаэдр, почти сферический многогранник, составленный из 20 треугольников. Однако вирус Q-бета еще задолго до древних греков собирал свой маленький дом в виде почти идеального икосаэдра. 178 копий одного кодируемого фагами белка сами соединяются, чтобы сложить коробочку в форме икосаэдра, где находится вирусная РНК. Затем второй белок (в одном экземпляре) запечатывает эту конструкцию. Этот же белок связывается с выростами в виде волосков на поверхности кишечной палочки, помогая вирусу распознать свою бактериальную добычу и проникнуть внутрь.

У каждого вируса есть свой собственный капсид, окружающий РНК-геном, защищающий его и помогающий заражать клетки. В РНК ВТМ закодирован единственный клиновидный белок, который собирается вокруг РНК в виде длинной цилиндрической трубки. РНК бактериофага Q-бета кодирует белок капсида, множество копий которого в виде икосаэдра собираются вокруг РНК, и еще один белок, который связывается с кишечной палочкой и облегчает вирусной РНК попадание внутрь

Некоторым РНК-вирусам достаточно капсида для образования «капсулы космического корабля», которая защищает РНК и обеспечивает ее доставку в нужное место. Однако у других вирусов капсид окружен дополнительным слоем – мембранной оболочкой из липидов. Например, таковы вирусы гриппа, респираторно-синцитиальный вирус и коронавирусы, в том числе и SARS-CoV–2. Эти вирусы не создают липидную мембрану сами, они воруют ее, когда собираются внутри хозяйской клетки. Мытье рук с мылом обеспечивает очень эффективную защиту против вирусов в такой оболочке, потому что мыло растворяет липиды в вирусной мембране и таким образом разрушает вирус. Смывать жир или масло с рук простой водой неэффективно – вода скатывается, а жир остается. Мыло же растворяет жир, точно так же как и вирусную мембрану.

Вирусы, покрытые мембранной оболочкой, как, например, SARS-CoV–2, заражают клетки человека, сначала соединяясь с рецепторами на поверхности, затем сливаясь мембранами с клеткой человека, что позволяет РНК (темная линия) проникнуть внутрь. Рецептор ACE2 закреплен в клеточной мембране, состоящей из липидов. У каждого липида есть отрицательно заряженная головка и два жирных хвоста. Эти липиды при взаимодействии друг с другом образуют двойной слой

Надевая новую липидную оболочку, вирус украшает ее одним или несколькими белками собственного производства; например, шиповидный белок SARS-CoV–2 образует 90 выростов на поверхности вируса, напоминающие зубцы короны. Именно шиповидные белки связываются с определенными рецепторами на поверхности человеческих клеток в легких, носовой полости, кишечнике, коже или мозге, позволяя вирусу попасть внутрь. Этот же шиповидный белок служит мишенью для антител, образующихся при вакцинации.

Зрелые вирусные частицы выходят из клетки, используя систему экзоцитоза, разработанную клеткой для вывода собственных белков. В общей сложности один вирус SARS-CoV–2, попавший в клетку, может произвести около 600 потомков за 8 часов. Если каждый из них заразит другую клетку, то количество потомков одного вируса составит 360 000 за 16 часов и 216 млн за сутки. Не удивительно, что вирусная инфекция так быстро превращает нас из совершенно здоровых людей в лежачих больных.

Мы говорим о вирусах как о сущем бедствии. Они доставляют неудобства и лишают трудоспособности нас самих, наших близких и друзей, нарушая созидательное течение нашей жизни. Иногда они даже убивают нас. Тем не менее трудно не восхититься их эффективностью. Совершенно поразительно, как они смогли перевернуть весь мир с ног на голову, имея в распоряжении всего несколько генов. Конечно, они полностью зависят от безалаберной клетки, которая помогает им и удовлетворяет большинство их потребностей для завершения их жизненного цикла. Вирусы – непревзойденные эксплуататоры.

Помимо всех этих достижений, вирусы чрезвычайно адаптивны. Они совершают достаточно ошибок при копировании собственной РНК, так что почти каждый из них немного отличается от своих братьев и сестер. Поэтому, если условия среды изменятся, если, например, они столкнутся с антителами или противовирусными препаратами, в популяции, скорее всего, найдется несколько вирусов, способных справиться с возникшей проблемой. Только понимая, как вирусы устроены и как они функционируют, мы можем эффективно с ними бороться. Как показала пандемия COVID–19, РНК-вакцина – отличный способ справиться с РНК-вирусом. Благодаря человеческой изобретательности мы смогли обернуть таланты РНК против нее самой.

После того как Джонас Солк в 1950-х гг. создал первую эффективную вакцину против полиомиелита, он получил возможность построить исследовательский центр своей мечты на 11 гектарах океанского побережья в калифорнийской Ла-Холье. Солк попросил архитектора Луиса Кана создать что-то «достойное визита Пикассо». Получившееся в результате сооружение из тикового дерева и бетонных блоков сегодня известно как шедевр архитектуры и оплот передовой науки. Но мало кто понимает, что Институт биологических исследований Солка, названный в честь человека, чья вакцина уберегла мир от одной пандемии, стал также местом зарождения идеи мРНК-вакцин, с помощью которых спустя много лет удалось взять под контроль другую пандемию. Этот факт остается незамеченным, поскольку путь от революционной идеи до ее спасительного воплощения содержал больше изгибов и поворотов, чем скалистая береговая линия в том месте, где стоит институт.

В 1989 г. Боб Мэлоун, бывший тогда аспирантом, работал в Институте Солка в лаборатории Индера Вермы, специалиста по введению генов в человеческие клетки с помощью вирусов. Эта технология легла в основу зарождавшейся новой области – генной терапии, где ДНК используется для лечения или профилактики заболеваний. Чаще всего для этого человеку вводят новую копию здорового гена, чтобы компенсировать влияние гена дефектного. Очевидно, что этим способом можно было лечить такие заболевания, как серповидноклеточная анемия, мышечная дистрофия и муковисцидоз, где мутировавший ген был хорошо известен. Поскольку генная терапия могла обеспечить стойкое выздоровление при таких заболеваниях, она в то время была актуальной темой в университетах и компаниях поблизости от Сан-Диего.

Помимо генной терапии, ученые в то же самое время работали над смежной темой ДНК-вакцин. Эти два подхода объединены общей идеей: вместо того чтобы вводить человеку полезный белок, можно пойти напрямик и ввести ген для синтеза этого белка, чтобы клетки сами копировали информацию с ДНК в виде мРНК, а потом на основе этой информации вырабатывали белок. Но если задача генной терапии – изменить геном человека навсегда, то в случае с ДНК-вакцинами даже временной выработки вирусного или бактериального белка может быть достаточно, чтобы иммунная система человека научилась распознавать незваных гостей.

В 1980-х гг. ученые были воодушевлены возможностями ДНК-терапии, но работавший в Институте Солка Боб Мэлоун увидел главный потенциальный недостаток этого метода. Когда людям вводили ДНК, невозможно было предсказать, куда именно в геноме она встроится. Возьмем для сравнения гаечный ключ – изначально полезный инструмент, хорошо подходящий для закручивания гайки на болте. А теперь представьте, что этот гаечный ключ бросили куда-то в автомобиль. Он может попасть туда, где это не опасно, – на пол, на подушку сиденья, в багажник, бардачок или на приборную панель. Но если он застрял где-то внутри двигателя, колесного диска, амортизатора или карданного вала, то может помешать работе автомобиля. А если гаечный ключ попадет под педаль тормоза или на педаль газа, автомобиль может выйти из-под контроля. Аналогичные опасения возникают и в отношении ДНК-терапии. Если ДНК, несущая посторонний ген, случайным образом встраивается в геном пациента, она может оказаться в части хромосомы, не служащей переносчиком важной информации, и тогда не причинит вреда. Но если по роковой случайности она прервет работу здорового гена или запустит экспрессию гена, стимулирующего деление клеток, это может вызвать заболевание, в частности онкологическое. И действительно, несколько лет спустя обрела широкую известность история, когда у ребенка, получавшего генную терапию при лечении тяжелого комбинированного иммунодефицита – «синдрома мальчика в пузыре», развилась лейкемия: введенная ДНК случайно попала в хромосому рядом с геном, стимулирующим рост клеток, и включила его активность.

Мэлоун и Верма поняли, что проблемы можно избежать, если инструкции по производству белка вводить в организм в виде мРНК, а не ДНК. Ведь мРНК не встраивается в ДНК больного, таким образом, исключается возможность постоянных нежелательных изменений. Спустя 30 лет эта некогда мало кому известная идея получила воплощение и широкое распространение в виде мРНК-вакцин.

Даже по самым скромным подсчетам, мРНК-вакцины спасли миллионы жизней в борьбе с COVID–19. Сейчас такие препараты разрабатывают не только против других вирусов (от респираторно-синцитиального вируса до обычной простуды), но и против опухолей. Хотя будущее мРНК-вакцин кажется блестящим и, возможно, они даже произведут революцию в медицине, история их разработки остается туманной и не совсем понятной. Как всегда в вопросах здравоохранения, отсутствие четкой информации привело к путанице и создало благоприятную почву для теорий заговора.

Помню, как весной 2020 г. мРНК-вакцины впервые попали в газетные заголовки. Репортеры и пользователи социальных сетей обсуждали мРНК так, словно это какое-то чужеродное вещество, новый препарат. Многие не понимали, что, хотя мРНК действительно лишь недавно стала использоваться в качестве вакцины, это естественная и важная часть каждой клетки нашего организма и каждой клетки любого другого организма на Земле. Из-за отсутствия знаний об РНК вспыхнули опасения, что мРНК-вакцины – нечто однозначно опасное.

Однако не только отсутствие знаний о природе мРНК способствовало подозрительному отношению к таким вакцинам. Еще одним фактором была молниеносная скорость их появления. Поражал тот факт, что безопасные и эффективные мРНК-вакцины были предложены, изготовлены, проверены и одобрены для экстренного применения всего за год, тогда как обычно на разработку вакцин требуется от шести до восьми лет.

Как ученым удалось так быстро это сделать? Если коротко, то никак. Хотя вакцина от COVID–19 создавалась в рекордные сроки, в ее основу легли научные открытия, сделанные на протяжении десятилетий. Представьте себе, что вакцина – это пазл. То, как быстро он был собран, впечатляет, но все кусочки уже лежали на столе, когда разразилась пандемия. Сложность заключалась в том, чтобы понять, как их соединить вместе. А в качестве дополнения к собранному пазлу стало ясно, что полученные знания можно использовать для разработки мРНК-вакцин против новых вирусов и других опасных для жизни заболеваний.

Первое, что необходимо для создания мРНК-вакцины, особенно такой, которая предназначена для иммунизации значительной части 8-миллиардного населения планеты, – это возможность синтезировать мРНК в нужных количествах, в идеале вагонами. Один трудолюбивый биохимик, Билл Стьюдер, нашел этот первый важный фрагмент головоломки еще в начале 1980-х гг.

Стьюдер родился в 1936 г. и вырос в Уэверли, маленьком городке Айовы. Он учился в Йельском университете, затем защитил диссертацию в Калифорнийском технологическом институте и был в постдокторантуре Стэнфорда. В 1964 г. он работал в Брукхейвенской национальной лаборатории на Лонг-Айленде (штат Нью-Йорк), возглавляя исследовательскую группу, изучавшую бактериофаг Т7 – вирус, который поражает кишечную палочку.

Брукхейвенская национальная лаборатория унаследовала здание военной базы Аптон, которая была закрыта после Второй мировой войны, и превратила его в исследовательский центр по разработкам методов мирного использования атомной энергии. В лаборатории имелся также биологический отдел, где Стьюдер получил возможность изучать то, что ему было интересно, без оглядки на коммерческое или медицинское применение. Фаг Т7 был именно такой темой. Как может ДНК-вирус, заражающий бактерии, иметь какое-то отношение к медицине?

Стьюдер был очарован невероятной эффективностью, с которой Т7 использовал бактерию для собственных нужд, превратив незадачливую клетку в фабрику по производству новых фагов. Ученый выяснил, что сначала фаг захватывал принадлежащий кишечной палочке механизм копирования ДНК в виде РНК, а именно – в РНК-полимеразу, и использовал ее для создания копий собственной РНК-полимеразы. Как только РНК-полимераза фага была сделана, она не тратила усилия на гены кишечной палочки, а была настроена на копирование только генов фага и образовывала мРНК для создания белков фага. Такой исключительной специфичностью фаговая полимераза обладала потому, что работала только там, где была определенная последовательность из 17 пар оснований ДНК, – это так называемый сайт инициации, расположенный в начале каждого гена фага. Таким образом, полимераза могла полностью игнорировать все соседние бактериальные гены, у которых не было такого сайта. Короче говоря, РНК-полимераза фага Т7 была сверхпродуктивной машиной для синтеза РНК.

РНК-полимеразу фага Т7 можно использовать для транскрипции практически любой требуемой РНК. Ученый добавляет сайт инициации Т7, состоящий из 17 пар оснований, перед геном, который нужно скопировать. Затем полимеразы собирают мРНК из нуклеотидных строительных блоков (здесь изображены две полимеразы, идущие слева направо). На последнем показанном этапе рибосомы считывают информацию с мРНК и синтезируют белки. Например, рибосомы в клетке вакцинированного человека используют введенную мРНК для синтеза шиповидного белка коронавируса

Еще в 1981 г. Стьюдер предсказал, что Т7 РНК-полимеразу можно перенаправить на синтез мРНК, кодирующей любой нужный белок[248]. Вскоре они с коллегой Джоном Данном воплотили это предположение в реальность. Им удалось выделить ген фага Т7, кодирующий РНК-полимеразу Т7[249]. Затем они встроили этот ген в кишечную палочку, так что почти вся бактериальная клетка заполнилась РНК-полимеразой Т7, которую они потом легко смогли очистить. От внимания Стьюдера и Данна не ускользнуло, что Т7 РНК-полимеразу можно использовать в лаборатории для производства определенных РНК и синтеза нужных белков внутри клеток[250]. То, что этим белком окажется шиповидный белок коронавируса, никому из них тогда в голову прийти не могло.

Следующим кусочком пазла, необходимым для создания мРНК-вакцины, был способ доставки – следовало помочь мРНК проскользнуть в клетку человека сквозь защитную оболочку. Как мы уже видели на примере миРНК-препаратов, РНК трудно проникнуть через липидные мембраны, защищающие клетку. Фил Фелгнер первым понял, что липидные оболочки не только осложняют попадание нуклеиновых кислот внутрь клетки, но и способны помочь решению этой проблемы. Он был убежден, что, если РНК-вирусы умеют проникать в человеческие клетки, значит, можно покрыть мРНК-лекарство липидной оболочкой, как у вируса, и преодолеть таким образом трудности доставки.

Возможно, столь креативное решение было найдено благодаря артистическому темпераменту Фила. Прежде чем сделать научную карьеру, он жил в Сан-Франциско, учился играть на классической испанской гитаре и выступал в кафе[251]. Закончив постдокторантуру в штате Вирджиния, он вернулся в район Залива в Сан-Франциско, устроился в корпорацию Syntex и начал разрабатывать липидные средства доставки мРНК.

К счастью, Фил оказался достаточно смелым, чтобы сделать ставку на липиды. Об этих жирных маслянистых молекулах большинство исследователей РНК и ДНК обычно стараются даже не вспоминать. РНК и ДНК ведут себя хорошо – их легко выделить в чистом виде и легко растворить в воде. Липиды же представляют собой обширную группу ускользающих молекул, которые плохо растворимы в воде, но любят собираться вместе с другими липидами. Миллион липидных молекул образует нечто похожее на уличную толпу в Буэнос-Айресе после победы Аргентины на чемпионате мира в 2022 г. – скопление тесно прижатых друг к другу тел, когда при этом отдельные люди перемещаются в массе, так что их положение каждую минуту меняется. Точно так же липиды плотно прилегают друг к другу, образуя мембрану, которая окружает и защищает клетку или обернутый ею вирус.

Во время работы в Syntex Фил понял, насколько сложно создать липидные средства доставки нуклеиновых кислот. Большинство липидов в естественных биологических мембранах заряжено отрицательно, так же как нуклеиновые кислоты ДНК и РНК, а следовательно, они отталкивают друг друга. Поэтому Фил попытался синтезировать положительно заряженные липиды для упаковки нуклеиновых кислот. Теперь они легко прилипали к нуклеиновым кислотам, но оказалось, что столь же легко они прилипают к любым попавшимся им клеточным мембранам, а это нехорошо, ведь ему надо было сделать вирусоподобную упаковку, которая циркулировала бы внутри организма. Но Фил не сдавался и в конце концов придумал, как получить положительно заряженные липиды, формирующие маленькие контейнеры липосомы с нуклеиновыми кислотами внутри[252].

Прогресс, которого добился Фил, работая в Syntex, был сведен на нет в 1988 г., когда его начальник сообщил, что липидный проект закрывается, поскольку он не сулит компании прибыли в ближайшей перспективе. В Syntex предположили, что технология больше подходит для отдаленного будущего – не раньше года 2020-го[253]. (Этот дикий прогноз оказался пророческим, поскольку вакцина против COVID–19, состоящая из упакованной в липидную оболочку мРНК, была одобрена Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов именно на третьей неделе декабря 2020 г.[254]) Фил, продолжавший интересоваться доставкой нуклеиновых кислот с помощью липидов, переместился на юг и основал в Сан-Диего корпорацию Vical. И вскоре с ним связались Боб Мэлоун и Индер Верма из Института Солка.

Использование мРНК в качестве лекарства или вакцины позволит избежать одной из опасностей ДНК-терапии: ведь РНК не вносит необратимые и потенциально опасные изменения в геном. Рассуждая так, Мэлоун и Верма были совершенно правы. Но они также понимали, что у мРНК есть свои недостатки, и в частности она уязвима перед присутствующими в организме и вездесущими рибонуклеазами – ферментами, разрушающими РНК, а еще она с трудом проникает в клетки. В итоге пришли к выводу, что новые липосомы Фила могли бы решить обе проблемы, поэтому все три исследователя начали сотрудничать.

Для первых экспериментов группа из Института Солка выбрала мРНК, кодирующую белок люциферазу светлячков, – не потому, что он имел какое-либо терапевтическое значение, а потому, что его было так же легко обнаружить, как огоньки светлячков в летнюю ночь. Содержащий РНК липосомный препарат смешали с растущими в чашках Петри культурами клеток разных видов – человека, мыши, крысы, лягушки и мушки дрозофилы. Когда клетки начинали светиться, как миниатюрные светлячки, было ясно, что мРНК попала внутрь клеток и с нее начался синтез белка[255]. Таким образом, к 1989 г. ученые убедительно доказали, что мРНК можно использовать, чтобы перепрограммировать клетки на производство чужеродного белка.

Далее надо было проверить, сработает ли это на живом организме, а не только в чашке Петри. В следующем году Боб Мэлоун и Фил Фелгнер вместе с Джоном Вольфом из Висконсинского университета провели эксперименты с введением мРНК люциферазы в мышцы мышам[256]. Вся мышь не светилась в темноте, но светились мышечные клетки рядом с местом инъекции. Это экспериментально доказывало, что чужеродные мРНК могут управлять синтезом соответствующего белка в организме млекопитающего. Но люди, интересующиеся медицинским применением результатов опытов, все еще были настроены скептично. Конечно, ткань, куда вводили мРНК, светилась, но в существенной мере это мог быть эффект люциферазы светлячков, поэтому оставалось непонятным, сколько именно белка синтезируется с помощью чужеродной мРНК. Многие сомневались, что с доставленной в липидной капле мРНК можно получить достаточное количество белка.

Скепсис сохранился, несмотря на дальнейшие исследования двух специалистов по производству вакцин во Франции. В 1991 г. Пьер Мельен и Фредерик Мартинон присоединились к ведущей компании по производству вакцин Pasteur-Mérieux. Эта легендарная организация, расположенная в сельской местности неподалеку от Лиона, производила вакцины из ослабленных версий инфекционных вирусов. Ими могли быть «вакцинные штаммы» вирусов – специально полученные вирусы с нарушенной репликацией либо вирусы, которые были подвергнуты тепловому или химическому воздействию и в итоге утратили бо́льшую часть своих репликативных способностей. Метод может показаться довольно примитивным, но часто работает: на поверхности поврежденного вируса остаются белки, которые иммунная система использует в качестве инструкции, чтобы подготовиться к настоящей вирусной атаке. Фактически большинство используемых на сегодняшний день вакцин производится именно такими способами.

Размышляя так же, как Мэлоун и Верма, Мельен и Мартинон решили, что гораздо эффективнее будет вакцинировать нуклеиновой кислотой, и пусть организм человека сам выполнит работу по расшифровке информации из нее для синтеза вирусного белка. Но какую нуклеиновую кислоту лучше использовать для вакцины – ДНК или РНК? Немного пугало, что РНК сложно производить и сделать стабильной, однако Мельен и Мартинон были воодушевлены успехами Мэлоуна и Вермы. Для них решающим фактором при выборе стала безопасность: чужеродная ДНК может встроиться в хромосому человека с непредсказуемыми последствиями, а РНК не встраивается в хромосомы, РНК может некоторое время руководить синтезом белков и затем будет вычищена клеточным ферментом рибонуклеазой[257].

Мельен и Мартинон хотели использовать мРНК для получения вакцины против гриппа. В целях предварительной проверки они синтезировали мРНК, кодирующую белок вируса гриппа, поместили мРНК в липосомы и подкожно ввели мышам полученную смесь. Вскоре они с восторгом обнаружили, что у многих мышей после инъекции выработались зрелые лимфоциты Т-киллеры[258], нацеленные на те клетки мыши, которые были заражены вирусом гриппа[259]. Когда эти Т-клетки обнаруживают клетку, зараженную определенным вирусом, они буквально проделывают в ней дыры и уничтожают ее. Важно, что Т-киллеры могут обеспечить долговременную защиту от вируса, сроком от нескольких месяцев до нескольких лет, в зависимости от конкретного вируса. Однако работы Мельена и Мартинона были встречены без энтузиазма как научным сообществом, так и потенциальными инвесторами, которые по-прежнему считали, что РНК слишком нестабильна и будущее за ДНК-вакцинами[260].

Хотя изобретенные Филом Фелгнером липидные частицы работали в культуре клеток, в экспериментах на животных липиды создавали некоторые проблемы[261], в частности вызывали значительное сокращение белых клеток крови, борющихся с болезнями, осложнения со свертываемостью крови и сильное воспаление. Ученые предположили, что эти побочные реакции возникли из-за того, что липиды имеют положительный заряд (поскольку в природе положительно заряженные липиды не встречаются). Нужны были липиды нового поколения, с другим строением. И в итоге они появились благодаря Питеру Куллису из Университета Британской Колумбии в Ванкувере и компаниям, которые он основал.

Поперечный разрез липидной наночастицы (ЛНЧ), размером сопоставимой с коронавирусом. Каждый липид имеет положительно заряженную головную часть (маленький кружок), которая связывается с мРНК, и два жирных «хвоста», которыми липиды поворачиваются друг к другу. В действительности для изготовления ЛНЧ используют смесь липидов, а не один их тип, как показано здесь для простоты. Каждая ЛНЧ содержит несколько молекул мРНК для вакцинации (темные нити)

Эти новые липиды впервые были разработаны в 1990 г. Они обладают свойством менять свой электрический заряд в зависимости от кислотности среды. В слабокислом растворе, который получается, например, при добавлении уксуса или лимонного сока, они несут положительный заряд – идеально для связывания и упаковывания отрицательно заряженной РНК в мельчайшие сверточки, которые назвали липидными наночастицами (ЛНЧ). Когда исследователь нейтрализует кислотность раствора, электрический заряд липидов исчезает. Отсутствие заряда помогает наночастице циркулировать по кровотоку, прилипать к поверхности клетки и проникать внутрь. Как только упаковка попадает внутрь нужной клетки, из-за более кислой среды заряд липидов вновь меняется на положительный. Важно, что липиды с внутренней стороны клетки заряжены отрицательно. Теперь отрицательный заряд притягивается к положительному, мембрана становится жидкой и разрушается, а ее РНК-груз высвобождается в цитоплазму клетки[262].

В 2018 г. успешно завершились первые клинические испытания лечения транстиретинового семейного амилоидоза, при которых основанная Томом Тушлем и Филом Шарпом компания Alnylam использовала разработанные Куллисом липидные наночастицы для доставки миРНК, разрушающих мРНК. Как оказалось, это было генеральной репетицией перед доставкой мРНК несколькими годами позже.

Даже при использовании подходящего средства доставки с помощью липидных наночастиц мРНК-вакцине все равно нужно было обойти защитный механизм, который называется врожденным иммунитетом. Как мы уже знаем, вирусы, вероятно, появились так же давно, как и организмы, на которых они нападают, поэтому у эволюции было достаточно времени, чтобы выработать противовирусные стратегии. Одна из них, врожденный иммунитет, встречается у всех животных, от червей и насекомых до мышей и людей. Он «врожденный», потому что не зависит от предшествующего знакомства с патогеном. (Приобретенный иммунитет, в котором участвуют антитела и Т-клетки, напротив, гораздо более специфичен, и для него требуется предварительное знакомство.) Врожденная иммунная система распознаёт вирусную РНК, ориентируясь на отличия от нормальной человеческой РНК[263]. Например, промежуточные продукты репликации вирусной РНК двуцепочечные, потому что на основе плюс-цепи формируется минус-цепь, и наоборот. Длинные двуцепочечные РНК редко встречаются в неинфицированных клетках. Кроме того, вирусные РНК содержат обычные А, Г, Ц и У, тогда как клеточные РНК украшены различными нуклеотидными модификациями – к некоторым основаниям дополнительно прицеплены небольшие химические группы.

Благодаря распознаванию отличительных признаков вирусной РНК врожденная иммунная система день за днем обеспечивает нам противовирусную защиту, но это может помешать РНК-вакцинам. Тот же самый врожденный иммунный ответ, который запускается на вирусные РНК как на чужеродные, может реагировать как на чужеродные и на мРНК-вакцины, а в результате возникнет неприятная воспалительная реакция, сопровождающаяся сыпью, лихорадкой, головной болью и болью в суставах[264]. Не удивительно, что врожденному иммунитету трудно разобраться, намерена пришедшая РНК принести пользу или она замыслила что-то коварное. Поэтому еще одним ключевым элементом головоломки стала маскировка РНК: ее нужно было сделать непохожей на вирусную. И тут появляется Каталин (Кати) Карико.

Карико родилась в Венгрии в 1955 г., она увлеклась биохимией в пятилетнем возрасте, когда увидела, как мама варит мыло из животного жира и щелока. Но после защиты диссертации Карико поняла, как мало возможностей для научных исследований в коммунистической Венгрии. Поэтому в 1985 г. она вместе с мужем и двухлетней дочерью сбежала в США. Те небольшие деньги, которые у них были, она зашила в плюшевого мишку своей дочки[265].

К 1990 г. Карико была преподавателем в Пенсильванском университете. Она увлеклась разработкой лекарственных средств на основе мРНК. Но агентствам, выдающим государственные гранты, ее идея казалась нереалистичной. «Каждую ночь я работала: грант, грант, грант. И [в ответ] всегда приходило: нет, нет, нет»[266]. Цель показалась нереалистичной и ее университетскому руководству, и в 1995 г. Карико понизили в должности.

Затем, три года спустя, возле копировального аппарата произошел счастливый случай. До появления электронной подписки на журналы ученые делали ксерокопии статей из библиотечных журналов, чтобы почитать вечерком. Карико часто соперничала с новым преподавателем Дрю Вайсманом за доступ к ксероксу. После того как они столкнулись несколько раз, каждый из них понял, какие статьи копирует другой, и стало очевидно, что их интересы совпадают[267].

Вайсман был иммунологом и искал способ улучшения вакцины для людей. Карико была ученым, специалистом по РНК, убежденным, что возможность получать белки в терапевтических целях, используя мРНК, недооценивается. Они дополняли друг друга не только по научным интересам, но и по характеру. Карико была разговорчивой и энергичной, а Вайсман – более сдержанным и методичным[268].

Они вместе придумали, как замаскировать мРНК, чтобы врожденная иммунная система не сочла ее вирусной. Они обнаружили, что буква У в алфавите РНК – основной признак, по которому иммунная система распознаёт РНК, вероятно, потому, что это единственная буква, которая есть в РНК, но отсутствует в ДНК. Поэтому в 2005 г. Карико и Вайсман попробовали заменить все буквы У в мРНК различными модифицированными версиями У и обнаружили, что некоторые из модифицированных версий, в том числе та, которая называется псевдоуридин, в значительной степени игнорируются врожденной иммунной системой[269].

Важно отметить, что РНК-полимераза Т7, которую Билл Стьюдер изначально использовал для научных исследований, благополучно приняла этот модифицированный У и включила его в нужные участки растущей РНК-цепи. Рибосома тоже его приняла, прочитав как обычный У. Более того, синтез белка оказался даже более эффективным, когда мРНК содержала псевдоуридин. И даже сверх того: клеточные рибонуклеазы, так же как иммунная система, с трудом распознавали РНК с псевдоуридином, поэтому модифицированная РНК оказалась более стабильной, чем естественная[270]. Казалось, все слишком хорошо, чтобы быть правдой: две функции, которые необходимо было сохранить, – транскрипция и трансляция – при использовании псевдоуридина сохранялись или улучшались[271], тогда как два нежелательных эффекта – активация врожденного иммунитета и расщепление – подавлялись.

Среди компаний, получивших лицензию на использование технологии, предложенной Карико и Вайсманом[272], были BioNTech и Moderna. Изначально эти биотехнологические компании собирались применить ее для борьбы с раком. Но ничто так не меняет ваши планы, как потрясшая весь мир пандемия.

10 января 2020 г. профессор Юн-Чжэнь Чжан из Фуданьского университета в Шанхае разместил последовательность РНК нового коронавируса на сайте со свободным доступом[273]. Важность этого ориентированного на общественное благо поступка оценили не сразу, поскольку тогда за пределами Китая новый вирус вызывал лишь небольшие опасения. Да, он был родственен коронавирусам, повлекшим две предыдущие вспышки тяжелого острого респираторного синдрома – SARS в 2002 г. и MERS в 2012 г., но каждую из них удалось сдержать, и в результате от них в мире погибло менее 1000 человек. Однако у нового коронавируса, вскоре получившего название SARS-CoV–2, была другая судьба. Он оказался бедствием для планеты.

По какой-то причине ученые из тогда еще малоизвестной биотехнологической компании Moderna, расположенной в Кембридже (штат Массачусетс), в том же месяце поняли, что новый коронавирус представляет собой бо́льшую угрозу, чем SARS или MERS[274]. Ученые из столь же малоизвестной компании BioNTech в немецком городе Майнце тоже читали сообщения о новых случаях заражения в Ухане и увидели признаки зарождающейся пандемии: множество инфицированных, наличие бессимптомных носителей, которые могли невольно распространять вирус, и никаких попыток ограничить перемещение, чтобы сдержать вспышку[275]. Обе компании занимались разработкой лекарственных препаратов на основе матричной РНК. И обе компании поняли, что технологию мРНК, которую они используют, можно быстро перенастроить на создание белка, способного послужить вакциной против нового коронавируса.

Во многих отношениях эти компании сделали очень смелый шаг, учитывая, что на тот момент не существовало доказательств полезности хоть какой-нибудь мРНК-вакцины. Но все необходимые детали головоломки лежали перед ними на столе. В течение шести десятилетий ученые раскрывали тайны мРНК. Они расшифровали генетический код, поэтому любой мог прочитать определенную Юн-Чжэнь Чжаном последовательность SARS-CoV–2 и понять, как делать шиповидный белок. Они показали, что с помощью мРНК можно произвести достаточное количество белка, чтобы вызвать иммунный ответ, а это необходимо при разработке вакцины. Они разработали мощные технологии, позволяющие на основе ДНК сделать очень много РНК. Они узнали, что для введения РНК в клетку человека можно использовать сочетание липидов с РНК, и изобрели крошечные жировые шарики – липидные наночастицы. А еще они обнаружили, что основание У в мРНК можно заменять на модифицированный вариант, чтобы замаскировать мРНК и не вызывать нездоровой воспалительной реакции.

И все-таки любому, кто собирал пазл, известно, что после того, как на столе разложены все кусочки, начинается тяжелая работа. Чтобы понять, насколько сложно было создать эффективную вакцину от COVID–19, вспомним, что в гонке наряду с изобретателями мРНК-вакцин участвовало более десятка других соперников и многие из них использовали проверенные технологии[276], которые, казалось, с большой вероятностью сработают и здесь. Многочисленные участники состязания практиковали самые разнообразные подходы. Одни взяли инактивированные вирусы SARS-CoV–2, другие искусственно создали менее опасный вирус для выработки белка шипа, третьи предложили ДНК-вакцины. Некоторые методики в итоге привели к получению вполне достойных вакцин, как, например, ДНК-вакцина Oxford-AstraZeneca[277], первоначально использовавшаяся в Великобритании. Однако они не достигали такой эффективности, которая была у двух мРНК-вакцин. Ряд вариантов не вызвал достаточно сильного иммунного ответа, и в итоге образцы были отброшены.

Чтобы сложить весь пазл и создать мРНК-вакцину, требовались недюжинный талант, творческий подход, выдержка, а также поистине выдающиеся ученые. Среди них особенно интересны истории Угура Шахина и Озлем Тюреджи. Родившийся в Турции Угур Шахин переехал в Германию, когда его отец получил работу на автомобильном заводе Ford в Кельне. У Озлем Тюреджи тоже турецкое происхождение; ее мать – биолог, отец – хирург, оба иммигрировали из Турции в Германию. Шахин и Тюреджи познакомились в 2001 г., когда оба работали врачами в больнице германской земли Саар. Они поженились в 2002 г., и у них родилась дочь. Помимо семейных забот и радостей, их объединяет профессиональная страсть: они жаждут использовать новые научные достижения в областях, где ощутимы неудовлетворенные медицинские потребности, в частности в иммуноонкологии, которая занимается стимуляцией иммунной системы для распознавания и уничтожения опухолевых клеток.

В 2008 г. Шахин и Тюреджи основали компанию BioNTech с целью разрабатывать вакцины от злокачественных образований на основе мРНК (подробнее об этом чуть дальше). Работа была сложной, но в течение следующего десятилетия они достигли прогресса: шли клинические испытания более десятка соединений, и в январе 2020 г. наступил тот судьбоносный день, когда они приступили к новой задаче.

Мишенью для вакцины от COVID–19 должны были быть выдающиеся шиповидные выросты, которые придают коронавирусу его короноподобный вид. 90 выростов, образованные шиповидным белком[278], выступающие из липидной оболочки, окружающей коронавирус, – это первое, с чем сталкивается иммунная система, когда узнает о готовящейся атаке коронавируса. Поэтому стимуляции иммунной системы шиповидным белком должно быть достаточно, чтобы иммунная система сразу же распознала настоящий вирус. Кроме того, поскольку белок шипа помогает вирусу проникать в человеческие клетки, антитела, которые будут с ним связываться и облеплять его, тоже должны помочь подавить вирусную инфекцию.

Знать последовательность РНК нового коронавируса для разработки мРНК, кодирующей шиповидный белок, необходимо, но это только начало. Прежде всего форма шиповидного белка была непостоянной, и, когда вирус проникал в клетку человека, шипы его короны меняли очертания. Если шиповидный белок, созданный на основе мРНК-вакцины, приобретал такую форму, то иммунная система могла обучаться искать именно ее. Антитела, вырабатывавшиеся при этом, не соответствовали шипам коронавируса, который только проник в организм, на стадии, когда можно предотвратить заражение, и, таким образом, вакцина оказывалась бесполезна. Решение заключалось в том, чтобы добавить в цепочку шиповидного белка пару молекул пролина – особенно негибкой аминокислоты[279], этот трюк был разработан для шиповидного белка родственного вируса MERS, и таким образом шип фиксировался на своем месте.

Шахин и Тюреджи должны были еще решить, какие кодоны использовать для кодирования шиповидного белка. Эта проблема актуальна для любой мРНК-вакцины, не только против COVID–19. Генетический код обладает свойством «вырожденности», благодаря которому большинство аминокислот могут быть заданы несколькими кодонами, поэтому один и тот же белок может кодироваться триллионами возможных комбинаций. Однако некоторые последовательности проходят трансляцию эффективнее других. Благодаря опыту, который Шахин и Тюреджи получили при работе над мРНК-вакцинами против рака, теперь они смогли выбрать 20 мРНК-последовательностей для дальнейшего тестирования[280].

Тем не менее оставалось еще много вопросов. Сколько доз потребуется для эффективной стимуляции иммунной системы? Как и при какой температуре следует хранить их вакцину? Как можно в кратчайшие сроки организовать клинические испытания на людях? Тогда они позвонили Катрин Янсен, руководителю отдела вакцин компании Pfizer, и быстро договорились о сотрудничестве. В итоге огромный опыт Pfizer в производстве вакцин был использован на благо обеих компаний и всего мира[281].

В ноябре 2020 г. руководители компании Pfizer Inc. находились в нервном ожидании. Им предстояло узнать результаты клинических исследований мРНК-вакцины, которую они разрабатывали совместно с BioNTech. Когда было объявлено о 95-процентной эффективности вакцины, раздался общий выдох, а затем аплодисменты и радостные крики[282]. Руководство надеялось хотя бы на 70-процентную результативность, что уже было бы достижением для здравоохранения. В таком случае вакцина от COVID–19 по эффективности оказалась бы где-то между вакциной против гриппа (эффективность около 40%, с разбросом, в зависимости от года, от 10 до 60%) и вакциной против кори (эффективность 97%)[283]. Показатель 95 процентов был выше всяких ожиданий. Консервативная фармацевтическая компания, имеющая репутацию не склонной к риску, сделала ставку на неопробованную мРНК-технологию, и этот шаг оправдался.

В Майнце и в Кембридже, несомненно, царило такое же ликование, потому что результаты испытания вакцины компании Moderna были получены примерно в то же время и также продемонстрировали 95-процентную эффективность. Учитывая, что BioNTech/Pfizer и Moderna работали независимо друг от друга и многое сделали по-разному, например выбрали неодинаковые кодоны для кодирования шиповидного белка, удивительно, что они пришли к финишу почти одновременно и с одинаковыми по уровню эффективности вакцинами[284]. Итак, мРНК-препаратам потребовалось 30 лет, чтобы пройти путь от всеобщего пренебрежения – «слишком нестабильные», «слишком трудно проникают в клетки», «слишком иммуногенны» – до заявления, что это «укол, который спас мир»[285].

За время пандемии мы вложили беспрецедентно много средств в разработку мРНК-вакцин против COVID–19 и получили море данных об их применении и эффективности. Мы узнали и об ограничениях таких вакцин: известно, как привитые люди продолжают заболевать, хотя, как правило, менее тяжело, и как трудно вакцине угнаться за вирусом, мутирующим столь быстро. Тем не менее вряд ли возможна более впечатляющая проверка нового препарата. И действительно, Нобелевский комитет признал будущий потенциал мРНК-вакцин, наградив в 2023 г. Карико и Вайсмана Нобелевской премией по физиологии и медицине. Присуждая им награду, Нобелевская ассамблея Каролинского института отметила: лауреаты совершили прорыв, который не только позволил создать эффективные вакцины против COVID–19, но и «фундаментально изменил наши представления о том, как мРНК взаимодействует с нашей иммунной системой», проложив путь «для вакцин против других инфекционных заболеваний»[286]. Могут ли белки, образовавшиеся после введения кодирующей их мРНК, обеспечить неудовлетворенные медицинские потребности, выходящие далеко за пределы получения вакцин? Действительно ли в методах лечения грядет мРНК-революция?

На самом деле мы пока еще этого не знаем. Нам, несомненно, нужны еще высокоэффективные вакцины против других вирусных заболеваний. Например, у существующих сейчас вакцин против гриппа весьма ограниченная эффективность, потому что они не могут соответствовать всему разнообразию вирусов гриппа, у которых более 60 подтипов, называемых штаммами. Вакцинация против какого-то одного штамма защищает вас в основном именно от него. Каждый год в феврале Всемирная организация здравоохранения анализирует эпидемиологические данные из всех регионов планеты и пытается предсказать, какие вирусные штаммы будут наиболее распространены в предстоящем сезоне гриппа. Эффективность вакцины снижается, если смешать слишком много штаммов, поэтому делают препараты только против трех (трехвалентные) или четырех (четырехвалентные) из них. При производстве такой вакцины, как правило, вручную вводят вирус нужного штамма в куриные яйца. (Перед прививкой у вас спрашивают, нет ли аллергии на яйца, потому что в вакцине сохраняется небольшое количество яичного белка.) Для производства вакцины требуется шесть месяцев, поэтому не удается точно нацелить ее именно на те штаммы вируса гриппа, которые появятся в следующем сезоне. Иначе говоря, к тому моменту, когда мы точно узнаем, какой штамм гриппа преобладает на сей раз, менять вакцину будет уже поздно. Теперь, благодаря вакцинам против COVID–19, у нас есть база для производства мРНК-вакцин и возможность приготовить их гораздо быстрее, чем при введении вируса в куриные яйца. Если сделать вакцины, более точно соответствующие штамму вируса в этом году, они могут быть более эффективными. И подумайте о том, что в одних только Соединенных Штатах мы сэкономим в год 140 млн куриных яиц – сколько же из них получится омлета!

Следующей крупной проверкой для мРНК-вакцин будет их использование не только против других вирусов, но и против рака. Напомним, что и BioNTech, и Moderna разрабатывали препараты для прививки против рака до того, как с такой пользой для нас отвлеклись на COVID–19.

Как будет работать такая вакцина против злокачественных опухолей, хотя бы в теории? Ответ может показаться не очень очевидным. Вакцины против вирусов понятны: вирус – чужеродный агент, он биологически отличается от человека, поэтому иммунная система распознаёт в нем чужака и работает на его уничтожение. Шиповидный белок коронавируса – хороший пример: он характерен именно для вируса, его не может быть у неинфицированного человека, следовательно, этот белок служит однозначным сигналом об опасности. Есть некоторые виды онкологических заболеваний, про которые известно, что они вызываются вирусами, например, рак шейки матки в большинстве случаев бывает вызван вирусом папилломы человека, поэтому, опять же, вполне понятно, как вакцина «Гардасил» компании Merck спасает тысячи и тысячи людей, которые раньше гибли из-за развившегося злокачественного заболевания[287]: нет вирусной инфекции – нет рака. Однако большинство его видов возникают не из-за вируса, а потому, что нарушаются нормальные клеточные процессы.

Создание вакцины против рака реально, ведь в опухолях вырабатываются аберрантные белки, которые не встречаются в здоровых тканях человека. Из-за мутаций в ДНК, вызванных такими мутагенами, как сигаретный дым (при раке легких) или ультрафиолетовое излучение (при меланоме), образуются мутантные белки, которые могут стать причиной развития заболевания. Для осуществления иммунного надзора у клеток есть естественный механизм: внутри себя они измельчают белки на кусочки и предъявляют эти фрагменты на поверхности снаружи мембраны, где их исследуют Т-клетки. Если предъявлены частицы мутантного белка, Т-клетки распознают их как чужеродные и убивают предъявившую клетку. Логика в том, что если в клетке вырабатывается вирусный или мутантный белок, то она, скорее всего, мутантная или опухолевая и в любом случае ею стоит пожертвовать для блага организма.

В начале 1990-х гг. иммунолог Эли Гильбоа из Университета Дьюка изучал, можно ли активизировать эту естественную систему и заблаговременно с помощью мРНК обучить иммунную систему животных распознавать и уничтожать опухолевые клетки. Он провел серию тестов на мышах, у которых с помощью генной инженерии вызывали рак легких с метастазами. В этом эксперименте было два новшества. Во-первых, вместо того чтобы вырабатывать конкретную мРНК, Гильбоа выделил все мРНК из опухолей в легких мышей, чтобы научить иммунную систему распознавать целый спектр мутантных белков и реагировать на них. Во-вторых, вместо того чтобы вводить мышам непосредственно мРНК, заключенную в липосомы, он сначала выделил из организмов мышей иммунные клетки особого типа, обработал их липосомами с мРНК и ввел эти клетки обратно мышам. Это делалось, чтобы ввести мРНК именно туда, куда требуется для обучения иммунной системы, а не надеяться, что мРНК найдет в мыши нужные клетки.

Результаты Гильбоа впечатляли. Мыши, иммунные клетки которых обрабатывались опухолевой мРНК, оказались защищены при последующем введении опухолевых клеток. Распространение рака легких у таких грызунов резко прекращалось[288]. Однако то, что хорошо работает на мышах, не всегда можно эффективно перенести на человека. Было проведено более 50 клинических испытаний различных мРНК-вакцин против рака, но пока ни один препарат не одобрен[289]. Теперь, используя весь опыт, полученный при создании вакцин против COVID–19, такие компании, как Moderna и BioNTech, перезапустили свои программы по разработке противораковых мРНК-вакцин[290]. В 2022 г. Moderna в сотрудничестве с Merck объявила о чрезвычайно многообещающих результатах разработки мРНК-вакцины против меланомы[291]. Может быть, победа уже близка.

Какой вклад, помимо новых вакцин, может внести мРНК-терапия? Большинство традиционных лекарств тоже подавляют развитие заболевания, но мРНК потенциально можно использовать на другом направлении – для восстановления функционального белка, который отсутствует или мутировал у больного. К числу заболеваний, вызванных мутантными белками, относятся серповидноклеточная анемия, мышечная дистрофия, муковисцидоз и спинальная мышечная атрофия (которую Адриан Крайнер помогал лечить с помощью антисмысловых РНК). Появляется, кроме того, возможность решить важную проблему, связанную с так называемыми редкими заболеваниями, от каждого из которых в мире страдает всего несколько тысяч человек. С использованием мРНК-терапии возникает надежда, что нам удастся создать единую мРНК-платформу, куда можно будет вставить именно ту кодирующую последовательность из огромного их количества, которая нужна конкретному пациенту, чтобы затем на ее основе организм вырабатывал соответствующий необходимый ему белок.

И под конец рассмотрим терапевтические антитела, которые повлияли на вектор развития фармацевтической промышленности в 1990-х гг. Терапевтические антитела – это полученные в лаборатории версии антител, вырабатываемых В-клетками нашей иммунной системы. Их можно настроить на специфичное связывание с белковой мишенью на поверхности клетки. В некоторых случаях простое связывание с белком подавляет процесс заболевания или такое связывание сопровождается последующими полезными эффектами, например гибелью больной клетки. Среди часто назначаемых лекарств на основе терапевтических антител – «Хумира» против ревматоидного артрита, «Китруда» и «Опдиво» против злокачественных опухолей, «Дупиксент» против экземы и «Стелара» против псориаза и болезни Крона. Поскольку эти терапевтические антитела представляют собой белки, их нельзя принимать в виде таблеток: наша пищеварительная система создана для того, чтобы переваривать белки, поступающие с пищей, и не отличает лекарственные белки от еды. Поэтому терапевтические антитела обычно вводят напрямую в кровоток. Для этого, о чем уже говорилось, больному надо прийти в больницу или медицинский центр и сидеть там в течение часа, пока лекарство будет медленно поступать из иглы в руку. Такое внутривенное введение препарата дорого, утомительно и часто болезненно для пациента. Поскольку у каждого белка есть соответствующая мРНК, теоретически возможно вводить не сами антитела, а мРНК, делая подкожную инъекцию, как при вакцинации. Мы пока еще не знаем, удастся ли с помощью такой мРНК получить необходимое для лечения количество антител, но сама идея привлекательна, и сейчас исследователи в области биомедицины этот подход изучают. Явно прошли те времена, когда инвесторы не хотели вкладываться в мРНК.

Научный принцип, лежащий в основе всех этих мРНК-препаратов, прост: во всех случаях, когда необходим белок для стимуляции иммунной системы или замещения отсутствующего либо мутантного белка, вероятно, возможно использовать соответствующую мРНК, чтобы ввести в организм инструкции для создания этого белка. Реализовать эту идею на практике довольно сложно, но успех при создании мРНК-вакцины против COVID–19 послужил мощным стимулом.

На сегодняшний день мы наблюдаем, как РНК трех разных типов были превращены в эффективные лекарства. Антисмысловая РНК с дополнительными химическими модификациями, повышающими ее стабильность и облегчающими доставку, доказала свою эффективность и успешно используется при лечении спинальной мышечной атрофии – смертельного детского заболевания. Малую интерферирующую РНК применяют для лечения редких разрушительных генетических заболеваний, и, возможно, скоро ее будут использовать для борьбы с нейродегенеративными расстройствами, такими как болезнь Альцгеймера и боковой амиотрофический склероз (БАС). А для борьбы с самой страшной пандемией нашего времени сделали эффективную вакцину из мРНК, и в будущем она сможет дать человечеству новые препараты для прививок и лекарства.

Во всех трех случаях терапия работает на уровне РНК, никаких изменений в гены человека не вносят. Вообще, как мы уже убедились, одно из очевидных преимуществ мРНК-вакцин в том, что отсутствует риск изменения генома. Далее мы расскажем, как другой естественный процесс с применением РНК, с помощью которого бактерии защищаются от вирусов, можно использовать в качестве инструмента для редактирования генома любых видов, и генома человека в том числе, причем с невиданной ранее скоростью и специфичностью. В отличие от описанных ранее вмешательств с помощью РНК, новая технология, о которой пойдет речь, обеспечивает постоянные изменения в геноме, именно поэтому она столь мощна и при неправильном использовании опасна. И снова именно чудо-молекула РНК выступает катализатором этой революции.

Представьте себе мир, где ученые смогут создавать устойчивые к жаре и засухе сельскохозяйственные культуры, которые будут процветать на потеплевшей планете, или микроорганизмы для связывания углерода, чтобы развернуть вспять процесс глобального потепления, или быстрые и безопасные средства для лечения разрушительных генетических заболеваний. Это утопическая картина будущего, преображенного с помощью CRISPR – технологии редактирования генов, которую в современных книгах расхваливают как «дающую невероятную мощь для контролирования эволюции», потрясающую перспективу «редактировать человечество» и возможность управлять «будущим человеческого рода»[292]. Но не все относятся к CRISPR с таким оптимизмом. Существуют и антиутопические варианты того, как может измениться мир, если безответственные люди или правительства используют CRISPR для создания стай боевых животных или полчищ управляемых сверхлюдей. Вдруг кто-то с помощью методов генной инженерии породит армию клонов, как в фильме «Звездные войны»?

С помощью CRISPR мы можем генетически модифицировать практически любой организм, будь то комар, кукуруза или человек. Хотя у многих людей CRISPR ассоциируется с генно-инженерной технологией, этот механизм был описан в качестве естественного процесса у бактерий, которые благодаря ему противостоят атакам таких вирусов, как бактериофаги, упоминаемые нами здесь снова и снова. Предположительно, война между бактериями и вирусами длится уже более миллиарда лет, и каждый раз, когда одна из сторон изобретает новый способ нападения, у другой появляется способ отразить атаку. То есть, по сути, CRISPR представляет собой систему, борющуюся с ДНК-вирусами, и это не что-то особенное, а всего лишь одна из множества форм защиты от фагов[293]. Но именно она была первой перенастроена для использования в генной инженерии. А феноменальные способности этой технологии обеспечиваются за счет РНК.

Система CRISPR для разрезания ДНК состоит из двух частей. Первая – белок Cas9 (сокращенно от CRISPR-ассоциированный 9). Это фермент, который работает как молекулярные ножницы, физически разрезая обе нити двойной спирали ДНК. Нам всем родители говорили, что не надо бегать с ножницами, и здесь существует та же опасность: ножницы для ДНК, если ими не управлять, могут причинить много случайных повреждений. И вот к делу подключается РНК. Я уже рассказывал про мою бывшую аспирантку Дженнифер Даудну, которая изучала секреты структуры РНК. В 2012 г. Дженнифер в соавторстве с Эммануэль Шарпантье сделали открытие, за которое получили Нобелевскую премию по химии в 2020 г. Они обнаружили, что, соединив фермент Cas9 с определенной «направляющей РНК», могут точно нацелить CRISPR-ножницы для разрезания любой генетической последовательности в нужном месте. Через несколько месяцев после того, как Даудна и Шарпантье объявили о своем открытии[294], несколько групп исследователей показали, что такое РНК-направляемое редактирование генома работает и в живых человеческих клетках. Это были команды Фэн Чжана в Массачусетском технологическом институте, Джорджа Чёрча в Гарварде и собственная лаборатория Дженнифер в Беркли[295]. Теперь пора было подумать о множестве других возможных применений CRISPR, например для инактивации онкогенов, вызывающих опухоли, или генов, кодирующих неправильно сворачивающиеся белки при болезни Альцгеймера либо при боковом амиотрофическом склерозе.

Как же именно РНК позволяет выделывать такие штуки? Мы уже неоднократно видели, что РНК – мастер по созданию комплементарных пар оснований и с помощью таких молекулярных соответствий нуклеиновые кислоты могут эффективно взаимодействовать друг с другом. Молекула РНК, связанная с белком Cas9, используя комплементарность, присоединяется к одной из двух нитей ДНК и таким образом с исключительной точностью определяет в геноме место для редактирования. До появления этой технологии методы редактирования определенных участков в геноме человека были дорогими, трудоемкими и настолько сложными, что это могли делать лишь несколько лабораторий в мире. Но сегодня после небольшой тренировки даже студенты могут собрать необходимые компоненты для системы CRISPR и за несколько недель стереть в гене неудачную мутацию или вообще его выключить. В моей лаборатории CRISPR употребляется так часто, что термин превратился в глагол – такой же, как «гуглить». «ЗаКРИСПРив» изменения в ген, мы можем посмотреть, как это проявится в культуре клеток, растущих в чашках Петри.

CRISPR активно осваивают не только у нас в лаборатории. Вокруг наиболее радикальных способов применения этой технологии пока еще ведутся дискуссии, что вполне разумно. Но уже около 7000 лабораторий в мире используют CRISPR[296], и в некоторых отмечены впечатляющие достижения. На подходе еще много новых открытий. Исследователи нередко используют эту технологию для внесения генетических изменений не только в отдельные клетки, но и на уровне целых организмов, например в мух дрозофил или в мышей. Ученые обычно избегают громких слов, тем не менее многие биологи описывают появление этой технологии как второе пришествие. И обычно называют происходящее «революцией CRISPR».

Чтобы понять энтузиазм ученых и по-настоящему оценить огромные перспективы системы CRISPR, надо начать с ее низменного происхождения. То, что мы сейчас называем CRISPR, впервые было обнаружено при изучении последовательности ДНК бактериальных геномов. Исследователи уже напрактиковались выявлять гены бактерий, кодирующие белок, то есть участки, которые содержат триплетные кодоны, начинающиеся со стартового кодона АТГ и заканчивающиеся одним из трех стоп-кодонов. Но ДНК CRISPR привлекла их внимание, поскольку это было нечто новое и необычное. Она содержала повторяющиеся палиндромные последовательности, читавшиеся одинаково как слева направо, так и справа налево, вроде фразы «А роза упала на лапу Азора»[297]. Между этими повторами располагались фрагменты последовательностей, которые, как выяснилось, имели не бактериальное происхождение, а были получены от фагов – вирусов, атакующих бактерии.

Казалось, бактерии помнят о предыдущих встречах с фагами. Позднее выяснилось, что эти повторяющиеся участки определяют место, куда поочередно вставляются новые образцы фаговых последовательностей[298], аналогично тому, как дополняется список контактов. Эти ДНК-участки получили очень длинное название – короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами (англ. clustered regularly interspaced short palindromic repeats), – которое исследователи, к счастью, и сократили до аббревиатуры CRISPR. Однако оставалось неясно, зачем они нужны.

Дженнифер Даудну в 2006 г. познакомила с CRISPR ее коллега из Беркли Джилл Бэнфилд. Первоначально Бэнфилд заинтриговали эти необычные наборы ДНК-последовательностей, а выявившиеся функциональные возможности оказались еще интереснее. Так, ученые, занимавшиеся производством йогурта, где используются полезные бактерии для сквашивания молока, обнаружили, что с помощью CRISPR пробиотические бактерии уничтожают нападающие вирусы[299]. Вскоре они и другие исследователи выяснили, что система CRISPR разрезает ДНК фага, чтобы ее уничтожить[300]. Как только бактерия заполучает фрагмент последовательности определенного фага в свой CRISPR-список, она становится невосприимчивой к атакам фагов этого типа. Как будто благодаря CRISPR бактерия могла кричать: «Мои предки уже встречались с тобой раньше, и ты очень плохой, поэтому я тебя уничтожу!» Система CRISPR немного похожа на человеческую иммунную систему, которая обучается за счет предыдущих встреч с инфекцией или вакцинации. Но CRISPR даже лучше, потому что у бактерий иммунитет встраивается в ДНК и передается из поколения в поколение. Бактерии уже рождаются в значительной степени вакцинированными.

Затем на сцену вышла РНК. Группа голландских исследователей под руководством Джона ван дер Оста обнаружила, что с участков CRISPR у бактерий транскрибируется малая РНК, которая каким-то образом управляет противовирусной защитой[301]. Но что же это за механизм? Разобраться в нем решила Дженнифер Даудна, поскольку она специализировалась на РНК, а РНК явно играла ключевую роль в CRISPR. Дженнифер в своей лаборатории решила заняться исследованиями по этому направлению. И вскоре она оказалась лидером в недавно сформировавшейся области науки[302].

В 2011 г. Дженнифер предположила, что CRISPR РНК (crРНК) обеспечивают специфичность этой противовирусной системы. Создавалось впечатление, что они выступают в роли указателей, определяющих, какая ДНК принадлежит фагу и какую надо разрезать, не затрагивая при этом бактериальную хромосому, в которой нет подходящей последовательности. Но если РНК занималась обнаружением той последовательности ДНК, которую надо разрезать, какой инструмент осуществлял само разрезание? Ясность была достигнута в результате сотрудничества Дженнифер с Эммануэль Шарпантье из Университета Умео в Швеции.

Эммануэль – хрупкая женщина, но когда она выходит на трибуну, то выступает так четко, внятно и разумно, что мгновенно завладевает вниманием любой аудитории. Дженнифер издалека восхищалась работами Эммануэль, а в 2011 г. на конференции в Пуэрто-Рико[303] им впервые посчастливилось встретиться. Когда они познакомились, Дженнифер отметила, что Эммануэль «говорит тихо, у нее тонкое чувство юмора и приятная непринужденность в общении»[304]. Радость от общения друг с другом часто предвещает удачное сотрудничество.

Эммануэль обнаружила, что при мутации белка Cas9 в бактерии, вызывающей стрептококковую ангину, бактерия перестает быть защищенной от нападения фагов – то есть система CRISPR больше не работает. Может быть, этот белок Cas9 и есть тот самый до сих пор не найденный фермент – ножницы, отвечающие за разрезание ДНК нападавшего вируса? И если так, то каким образом РНК, скопированные с образцов фаговых последовательностей (спейсеров), указывают место, в котором должны работать ножницы? Вопросы одинаково увлекали и Эммануэль, и Дженнифер, поэтому они договорились заняться ими вместе.

Чтобы проверить, действительно ли белок Cas9 выступает в роли ножниц для CRISPR, они решили выделить его в чистом виде и смешать в пробирке с возможными направляющими РНК. Затем туда добавили разные искусственно созданные ДНК. Какие-то из этих ДНК были копиями фаговых последовательностей, которые соответствовали направляющим РНК (то есть мишенями), а какие-то не соответствовали (контрольная группа). Если гипотеза верна, то в присутствии направляющей РНК фагоподобная ДНК будет разрезаться пополам, а контрольная ДНК останется нетронутой.

В лаборатории Дженнифер координацией исследований занимался Мартин Инек, скромный и очень талантливый постдокторант из Чехии. В лаборатории Эммануэль ту же работу выполнял польский аспирант Кшиштоф Чилински. По счастливой случайности оба они выросли вблизи чешско-польской границы[305] и говорили по-польски, что способствовало их частым беседам по Skype.

Первым делом надо было очистить белок. Кшиштоф отправил Мартину ген для белка Cas9, и Мартин немедленно приступил к работе. Он пытался заставить кишечную палочку вырабатывать нужный белок. Надо заметить, что вырабатывать белок в кишечной палочке на основе генов другой бактерии удается часто, но не всегда, поэтому Мартину и работавшему с ним студенту пришлось перебрать множество условий, прежде чем у них получилось оптимизировать процесс производства белка Cas9. Затем был проведен главный эксперимент: белок Cas9 смешали в пробирке с направляющей РНК, чтобы они могли связаться друг с другом, и добавили фагоподобную ДНК, в которой последовательность нуклеотидов соответствовала направляющей РНК, чтобы посмотреть, будет ли расщепляться эта и только эта ДНК.

И главный эксперимент… полностью провалился. ДНК-мишени вышли из реакции целыми и невредимыми.

Озадаченные коллеги устроили мозговой штурм. Возможно, гипотеза ошибочна и Cas9 вообще не был ферментом, разрезающим ДНК? Или в их смеси не хватает какого-то ингредиента? Эммануэль обнаружила вторую РНК, необходимую бактериям стрептококка для производства CRISPR направляющих РНК, ее назвали тракрРНК (сокращенно от «трансактивирующая CRISPR РНК»). Может быть, эта вторая РНК необходима белку Cas9 для расщепления ДНК?

Мартин попробовал новую смесь, где были как направляющая РНК, так и тракрРНК. На этот раз мишень оказалась аккуратно разрезана на два кусочка. Чтобы Cas9 и направляющая РНК вместе работали как генетические ножницы, им нужна была помощь тракрРНК: она играла роль большого пальца, удерживающего ножницы на месте, чтобы сделать разрез.

Важно, что расщепление целевой ДНК происходило с исключительной специфичностью[306]. Последовательности ДНК, не совпадающие с направляющей РНК, оставались нетронутыми, и неразрезанную ДНК можно было разрезать, просто сделав новую направляющую РНК, совпадающую по 20 нуклеотидам. Это было похоже на функцию «Поиск» в текстовом редакторе: введите строчку из 20 знаков – и программа выделит все места в тексте, где есть полное совпадение[307][308].

В бактериальной системе защиты CRISPR-Cas9 (слева) имеются направляющая РНК, которая распознаёт ДНК-последовательность фага (мишень), и тракрРНК, соединяющаяся с направляющей РНК и удерживающая белок Cas9. Затем Cas9 разрезает обе нити ДНК. В искусственно созданной форме CRISPR-Cas9, используемой для редактирования генома (справа), две отдельные РНК соединены и представляют собой единую направляющую РНК

Дженнифер и Мартин были не из тех, кто останавливается на достигнутом. Поэтому, когда они сели, чтобы посмотреть новые данные, Дженнифер поздравила Мартина с открытием, а затем переключилась на тему «Как это можно использовать?». Очевидно, смесь из двух отдельных РНК и белка для разрезания с помощью CRISPR отлично работала в пробирке и в бактериях. Но если предположить, что в перспективе эта технология будет использоваться в клетках человека, приходилось признать ее слишком сложной. Понадобится вводить в клетку три последовательности ДНК, чтобы клетка синтезировала три компонента: белок Cas9, направляющую РНК и тракрРНК. А затем затаив дыхание надеяться, что РНК-полимераза скопирует все три компонента на РНК, что мРНК, отвечающая за синтез белка Cas9, попадет на рибосому – и будет получен белок и, наконец, что все три компонента в итоге встретятся снова в ядре клетки, где в хромосоме их ждет ДНК-мишень. Возможно ли упростить эту систему?

Два опытных специалиста в области РНК быстро нашли ответ. Они поняли, как можно соединить направляющую РНК и тракрРНК в одну молекулу. Этот трюк был противоположным тому, что Дженнифер делала с рибозимом SunY, когда 25 лет назад была аспиранткой в лаборатории у Джека Шостака. Тогда она нашла способ собрать большую РНК из нескольких кусочков более удобного размера. Теперь, глядя на две CRISPR РНК, Дженнифер и Мартин поняли, как соединить их вместе, чтобы получить единую направляющую РНК. Когда этот динамичный дуэт – белок Cas9 и единая направляющая РНК – точно разрезал в пробирке свою ДНК-мишень, команда Даудна – Шарпантье сразу же обнародовала свое открытие[309] и оказалась в эпицентре захлестывающего, подобно цунами, внимания.

Если бы волшебные способности CRISPR ограничивались только разрезанием ДНК, это вызвало бы гораздо меньше интереса у научных лабораторий, а тем более у промышленности. Само по себе появление нового инструмента для разрезания ДНК не стало бы отдельной темой для разработки в биотехнологических компаниях. Но помимо открытия того факта, что РНК-направляемый Cas9 белок расщепляет ДНК с высокой точностью, были еще и другие аспекты.

Благодаря исследованиям сначала на дрожжах и других грибах, затем на дрозофилах и клетках млекопитающих ученые к тому моменту знали, что живые клетки не позволяют молекулам ДНК долго находиться в поврежденном состоянии. Целостность генома необходима для жизни. Очень и очень давно организмы нашли способ быстро восстанавливать поврежденную ДНК. Поэтому, когда экспериментатор с помощью CRISPR разрезает ген, в клетке запускаются механизмы восстановления. И в этот момент происходит редактирование генов[310].

Восстановление ДНК в эукариотических организмах, и в том числе у людей, происходит двумя разными путями. Первый – это выполненный, так сказать, на скорую руку процесс «экстренного восстановления», когда склеиваются концы сломанной хромосомы. Его научное название – негомологичное соединение концов, сокращенно NHEJ (англ. non-homologous end joining). «Соединение концов» говорит само за себя. «Негомологичное» означает, что двум концам не обязательно иметь комплементарные ДНК-последовательности, можно соединить любые два конца ДНК. Отличительная черта NHEJ – небрежность процесса соединения, в результате чего в месте ремонта могут теряться или вставляться несколько нуклеотидов. Иначе говоря, в результате этого процесса восстановленная ДНК часто оказывается с какими-то неприятными мутациями. Поэтому разрезание с помощью CRISPR и дальнейшее восстановление за счет NHEJ часто приводят к выключению гена из-за нарушения порядка нуклеотидов в цепи, кодирующей белок.

Чтобы показать, как это работает, обратимся снова к нашей любимой аналогии с текстами. Единая направляющая РНК находит нужную последовательность ДНК, подобно тому как функция «Поиск» находит последовательность знаков в документе. Мы вводим последовательность Тот наш кот, кодируемую ATГЦЦTTЦГ, и программа находит точное совпадение:

И снова стартовый кодон и стоп-кодон выделены курсивом. Теперь, когда направляющая РНК определила место действия, Cas9 разрезает здесь ДНК, как при нажатии Enter на клавиатуре. Текст разделяется разрывом строки:

Если теперь мы нажмем на Backspace, исходный текст будет восстановлен. Это похоже на восстановление ДНК с помощью NHEJ. Но помните, соединение по типу NHEJ неаккуратно: часто при склеивании концов по ошибке вставляется или удаляется одна-две буквы. Поэтому при образовании предложения возникнет опечатка – лишняя буква Т (отмечена подчеркиванием):

При вставке всего одной буквы предложение или ген теряет смысл. Такова цена быстрого и небрежного восстановления с помощью NHEJ.

Второй способ восстановления ДНК – гомологичная рекомбинация. Оборванный конец ДНК практически ищет поблизости совпадающую ДНК-последовательность – «гомологичную» часть – и затем подвергается рекомбинации с этой последовательностью, используя ее как шаблон для точного восстановления. Соответствующую последовательность ДНК можно найти на другой копии хромосомы, то есть хромосому, полученную от мамы, можно использовать в качестве образца для восстановления сломанной хромосомы, полученной от папы. Поскольку к гомологичной рекомбинации предъявляются более жесткие требования, чем к NHEJ, она происходит реже.

На первый взгляд кажется, что такое идеальное восстановление не пригодится для редактирования генов, да оно и не пригодилось бы, если бы просто восстанавливалась исходная последовательность ДНК. Но задолго до открытия CRISPR ученые обнаружили, что можно легко обмануть гомологичную рекомбинацию, введя[311] в качестве матрицы донорную ДНК, которая соответствовала бы участку вблизи места разрыва, но дальше находился бы дополнительный фрагмент. Дополнительный фрагмент при этом тоже копировался бы. Таким образом, ученые могли точно отредактировать ген. Или, более того, они могли ввести последовательность, которая вначале совпадает с геном, а затем в нее вставлен новый генетический элемент, так что получается совсем другой ген. До открытия CRISPR не существовало простого способа разрезать ДНК в нужном месте, чтобы обозначить место для рекомбинации. Но теперь с помощью технологии CRISPR это можно делать с поразительной точностью.

Чтобы представить себе, как работает гомологичная рекомбинация, отредактируем документ с помощью функций «Копировать» и «Вставить», добавив новые буквы, а затем сошьем предложение в прежний вид.

После того как CRISPR-Cas9 расщепляет ДНК в определенном месте, подключаются клеточные механизмы восстановления ДНК и занимаются редактированием гена. Негомологичное соединение концов (NHEJ) – быстрая и неаккуратная система ремонта, она обычно вставляет или удаляет небольшие фрагменты в месте починки. Гомологичная рекомбинация работает точно и при восстановлении использует информацию от донорной ДНК-матрицы. С помощью донорной матрицы можно ввести новые последовательности (пунктирная часть двойной спирали), чтобы исправить мутацию в геноме человека или добавить новый генетический элемент, если боковые участки в матрице совпадают с участками на ДНК-мишени

Вот информация на хромосоме:

А вот донорная матрица, которая начинается так же, как участок хромосомы, а затем содержит новую информацию:

В результате разрезания с помощью CRISPR и дальнейшей гомологичной рекомбинации предложение в хромосоме оказывается другим:

Теперь наш кот не ест суп или уху, а где-то ходит вместе с псом. Как функции «Копировать» и «Вставить» позволяют нам переписать предложение в документе, так РНК в CRISPR позволяет переписать код жизни.

Ажиотаж вокруг нового открытия, связанного с CRISPR, перекинулся по мосту через залив и добрался до Сан-Франциско. Еще до того, как статья Дженнифер и Эммануэль об их работе с CRISPR-Cas9 была опубликована в 2012 г., Дженнифер начала обсуждать с коллегами из Калифорнийского университета в Сан-Франциско, как использовать снайперскую точность CRISPR-Cas9 для включения или выключения определенных человеческих генов, вообще не разрезая ДНК.

Почему система с использованием CRISPR без разрезания может оказаться полезным генетическим инструментом? Хотя направляющая РНК могла запрограммировать систему так, чтобы Cas9 рассекал двуцепочечную ДНК в определенном месте, исследователь все равно ожидал, что затем разрыв будет устранен с помощью существующих клеточных механизмов. Восстановление было в некоторой степени случайным, чаще всего оно происходило за счет неаккуратного NHEJ и лишь изредка путем точной гомологичной рекомбинации. Как мы уже видели, у починки с помощью NHEJ непредсказуемые и порой опасные последствия, а этого ученые хотели бы избежать. Если нет разреза, то нет ДНК-концов и нет NHEJ.

Несколько групп ученых изменили белок Cas9 так, что лишили его возможности разрезать ДНК, но не повлияли на его способности связываться с единой направляющей РНК. Для краткости они назвали свое творение мертвым Cas9. Далее они обнаружили, что к этому мертвому Cas9 можно прицеплять разные белки, чтобы доставить их в нужное место человеческого генома. Например, белки, способные активировать или подавлять гены.

Аналогия, конечно, странная, но представьте себе, что вы хотите отправить кому-нибудь цветы, используя ракетный комплекс с лазерным наведением. Сначала вы обезвредите боеголовку, чтобы ракета не могла взорваться (эта часть – мертвый Cas9). Затем можно использовать систему наведения ракеты (направляющую РНК), чтобы с абсолютной точностью доставить букет к порогу дома. Вы вводите координаты и, вместо того чтобы взорвать дом, поднимаете людям настроение. Суть в том, что, разработав высокоточную систему доставки, можно доставлять разный груз.

Скорость, с которой были созданы и опробованы новые изобретения на базе мертвого Cas9, поражала воображение. Статья Дженнифер и Эммануэль об исходной системе CRISPR-Cas9 была опубликована в журнале Science 28 июня 2012 г. А уже в декабре того же года совместная группа Калифорнийского университета из Беркли и из Сан-Франциско прицепила к мертвому Cas9 известные генные репрессоры и активаторы[312] и показала, что человеческие гены можно включать и выключать по команде. Другие исследовательские группы тоже быстро присоединились к созданию инструментов на базе мертвого Cas9[313]. Редко бывает, чтобы исследования продвигались такими темпами. Конечно, следует отдать должное таланту и трудолюбию этих ученых, но главным фактором была немыслимая прежде надежность направляемого РНК Cas9 механизма. Если в руках своих вы держите молнию, самое время поразить ею!

Дэвид Лю, химик и биохимик из Гарварда, использовал мертвый Cas9, чтобы создать особенно полезный способ редактирования генов. Его интересовало, как отредактировать однонуклеотидную мутацию в гене, которая может быть причиной, например, серповидноклеточной анемии и многих других наследственных заболеваний человека. При использовании методов CRISPR первого поколения нужно было добавлять донорную ДНК-матрицу с правильной последовательностью и надеяться, что ДНК восстановится с помощью гомологичной рекомбинации, а не NHEJ, то есть процесс был возможным, но неэффективным. Дэвид знал, что много лет назад ученые нашли «ферменты для редактирования оснований», которые могли заменять одну букву в ДНК-алфавите на другую. Он решил, что может соединить один из этих редактирующих основания белков с мертвым Cas9 и таким образом удалить однонуклеотидную мутацию в месте, точно указанном направляющей РНК. Так он мог бы контролировать процесс редактирования генов, а не надеяться, что клетка исправит ген сама с помощью механизма гомологичной рекомбинации.

Предположения Дэвида подтвердились. Он обнаружил, что направляющая РНК действительно может навести фермент для редактирования оснований на любое место в геноме, которое нужно было исправить, и фермент заменит одну букву, например, Ц на Т в ДНК, не создавая разрыва в двух нитях. Новая буква Т затем транскрибируется в У на мРНК (подчеркнута на схеме ниже). Так что триплетный кодон изменится и будет обозначать правильную аминокислоту.

Одна буква кажется незначительным изменением, но в некоторых случаях это может быть вопросом жизни и смерти.

Ныне захватывающее время для исследований с CRISPR, поскольку каждый год появляются новые достижения. Исходный способ редактирования генов, при котором комплекс Cas9 с направляющей РНК используют для разрезания ДНК рядом с определенным местом и донорная матрица ДНК вводится для гомологичной рекомбинации, всё еще широко применяют и постоянно совершенствуют. Развиваются и различные стратегии с мертвым Cas9, использующие преимущества наведения комплекса Cas9 с направляющей РНК, но без разрезания ДНК, и один из примеров развития такого подхода – созданный Дэвидом Лю редактор оснований. Другие ученые исследуют альтернативные CRISPR-системы, где используются белки, родственные Cas9, например фермент Cas12a[314], который, видимо, разрезает ДНК так, что она с большей вероятностью будет восстановлена за счет гомологичной рекомбинации, а не с помощью NHEJ. Нам повезло, что на основе CRISPR уже существуют разные инструменты; если один из подходов окажется неприменим для лечения, в нашем распоряжении есть запасные.

Итак, с помощью наших генетических ножниц можно вносить точные правки в геном, но что именно нам следует редактировать?

Первый, самый очевидный ответ – мутацию, повлекшую генетическое заболевание. Как мы уже знаем из этой книги, многие генетические заболевания человека вызваны определенной мутацией в гене. Первым таким заболеванием, причина которого была выявлена на молекулярном уровне, оказалась серповидноклеточная анемия[315]. При этом заболевании из-за мутации одной пары оснований в гене бета-глобина, кодирующего субъединицу белка крови гемоглобина, происходит замена аминокислоты валина на глутамат. Все остальное в субъединицах гемоглобина сохраняется без изменений, поэтому мутантные белки бо́льшую часть времени работают более или менее нормально, перенося кровь по кровеносным сосудам. Но внезапно – под влиянием стресса, обезвоживания, физических нагрузок или инфекции – мутантные белки группируются внутри эритроцита, и форма клетки из нормальной, похожей на блюдце, превращается в серповидную. Эти деформированные клетки слипаются друг с другом, забивают кровеносные сосуды, состояние человека ухудшается и может оказаться настолько тяжелым, что потребуется госпитализация. В больнице могут попытаться справиться с болью или даже сделать переливание крови, но вылечить такого пациента невозможно.

Среди других генетических заболеваний человека, для которых известно расположение вызвавшей их мутации, – бета-талассемия (как мы отмечали, это первое заболевание, для которого было показано, что причина его – в нарушении сплайсинга), болезнь Тея – Сакса, муковисцидоз и многие формы мышечной дистрофии. Как и серповидноклеточная анемия, эти заболевания неизлечимы. Мы говорили в предыдущих главах о препаратах на основе РНК, где используется миРНК или мРНК; они могут быть полезны для лечения названных заболеваний, но не обеспечивают окончательного выздоровления, поскольку не способны полностью удалить мутантный белок. Теоретически добиться полного выздоровления возможно, если отредактировать мутантный ген, вернув ему нормальное состояние. С помощью CRISPR такое генетическое редактирование уже делают у дрозофил и мышей. Почему не у людей?

Потому что ученым, занимающимся биомедициной, нужно еще многое обдумать, рассматривая редактирование генов с помощью CRISPR в качестве терапии. Прежде всего, с какого заболевания начать? Ведь для разработки лечения от какого-либо заболевания исследовательским группам требуются годы работы плюс инвестиции порядка миллиарда долларов, поэтому так важно правильно выбрать заболевание. Один из важных факторов – отсутствие других эффективных способов лечения данного недуга, чтобы успешное редактирование гена имело действительно огромное значение.

Кроме того, болезнь должна быть очень тяжелой или даже смертельной, чтобы соотношение между пользой и риском было как можно выше. Это также должно быть заболевание, для которого лечебный эффект проявится уже после частичного восстановления правильного белка, поскольку пока невозможно отредактировать ДНК во всех пораженных клетках организма. Отсюда следует, что клетки, в которых наблюдается мутация, должны быть хорошо доступны, поэтому наиболее подходящей мишенью представляются болезни крови. Можно взять кровь из организма человека, обработать ее и влить обратно. Вспомним для сравнения болезнь Альцгеймера, поражающую мозг. Безусловно, получить доступ к почти 100 млрд клеток внутри мозга человека – невероятно сложная задача.

Серповидноклеточная анемия отвечает всем перечисленным критериям. Это очень тяжелое заболевание, от которого пока не существует лечения. Нам точно известно, какую пару оснований в ДНК нужно заменить, чтобы исправить белок гемоглобина. А человеческая кровь – легкодоступная ткань. Поэтому не удивительно, что у большинства крупных биотехнологических компаний, занимающихся CRISPR, есть программа по серповидноклеточной анемии[316]. В каждой компании используется собственный подход, и для науки это хорошо: несколько ударов по одним воротам повышают шансы попасть в цель. Хотя технология редактирования оснований с помощью мертвого Cas9[317], разработанная Дэвидом Лю, кажется идеально подходящей для таких целей, у нее есть здоровые конкуренты[318].

Однако даже для создания лекарства от серповидноклеточной анемии нужно преодолеть значительные сложности. Наши эритроциты, по сути, маленькие мешочки, набитые гемоглобином, они утратили свою ДНК, поэтому у них нет гена бета-глобина, который можно было бы отредактировать. Эритроциты образуются из стволовых клеток крови в нашем костном мозге. У этих клеток еще есть все их гены, и в том числе мутантный ген серповидноклеточной анемии, который надо отредактировать. Хорошая новость здесь та, что стволовые клетки продолжают делиться и образовывать новые эритроциты, поэтому, если мы починим ген в стволовой клетке, пользу от исправленного белка получат все дочерние клетки. А проблема в том, что этих стволовых клеток мало и их сложно выделить, а забрав их у пациента, придется содержать их в лаборатории, где должен происходить процесс редактирования генов, и это очень сложно. Отредактированные стволовые клетки затем надо так подсадить обратно пациенту, чтобы они смогли остаться в костном мозге (этот процесс называется приживлением). Зато, поскольку это собственные клетки пациента, иммунного отторжения, которое случается при использовании донорского костного мозга, быть не должно. И, в отличие от обычной трансплантации костного мозга, может не потребоваться облучения.

В 2020 г. Виктория Грэй, мать четырех детей из Миссисипи, которой тогда было уже за 30, стала первым пациентом с серповидноклеточной анемией, получившим лечение с помощью CRISPR[319]. Грэй всегда жила со страхом перед внезапным приступом ужасной боли. Часто она настолько сильно утомлялась, что не могла ухаживать за собственными детьми и оставалась на ночь в отделении неотложной помощи, где ей делали переливание крови, приносившее лишь временное облегчение. Теперь, после лечения с помощью CRISPR, она впервые наслаждается здоровой жизнью. Такие истории, безусловно, обнадеживают, но для точной оценки полезности и безопасности лечения с помощью CRISPR нужны клинические испытания, которые сейчас еще продолжаются. В 2023 г. лекарство на основе CRISPR под названием «экса-цел» («Касгеви») вошло в историю, получив одобрение для лечения серповидноклеточной анемии и бета-талассемии сначала от регулирующих органов Великобритании, а затем от Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов в США[320]. Будем надеяться, что к этому многообещающему препарату вскоре присоединятся другие лекарства, прошедшие клинические исследования.

Если вы владеете такими всемогущими генетическими ножницами, то возникает вопрос: почему ваши усилия ограничены исправлением мутаций в соматических клетках, а точнее, в клетках уже рожденного организма? Почему вы не применяете это к эмбриональным клеткам? Не эффективнее ли лечить наследственные заболевания, исправляя ошибку еще до рождения человека? Хэ Цзянькуй, профессор Южного университета науки и технологий в китайской провинции Шэньчжэнь, рассуждал именно так. Он стал изгоем в научном мире после того, как в 2018 г. объявил, что использовал CRISPR для генетического редактирования эмбрионов двух сестер-близнецов. Надеясь создать у них невосприимчивость к ВИЧ-инфекции, Хэ Цзянькуй удалил у эмбрионов белок, который ВИЧ использует для проникновения в клетки человека. В итоге ученого уволили из университета и приговорили к трем годам тюремного заключения за «незаконную медицинскую практику». Сохранив невозмутимость на фоне общественного скандала, он тем не менее, как сам сказал в 2023 г. британской газете The Guardian, понимает теперь, что «слишком поторопился»[321].

Его действия нарушают сложившиеся в научном сообществе представления о границах допустимого, когда речь идет о CRISPR и других способах редактирования генов. Это временные границы, они могут и должны быть пересмотрены по мере накопления данных об эффективности и безопасности. Первое ограничение заключается в том, что работать можно только с соматическими клетками[322] и нельзя использовать эмбриональные клетки или клетки зародышевой линии, от которых происходят сперматозоиды и яйцеклетки. Генетические изменения в соматических клетках не могут передаваться следующему поколению, а изменения в клетках зародышевой линии могут. Дело в том, что, если «корректировка» генов вдруг произойдет в неправильном месте (нецелевое редактирование), такое исправление должно остаться только у пациента, которого лечат, и не стать бременем для будущих поколений.

Второе общепризнанное ограничение касается «улучшений». Примером может служить использование CRISPR для редактирования генов с целью получения более совершенного потомства – более высоких, сильных, быстрее бегающих, выше прыгающих, более красивых, на ваш взгляд, детей. При таком применении CRISPR может превратиться в опасный инструмент евгеники. Хотя об этичности таких улучшений можно спорить, большинство людей согласится, что возможности CRISPR надо в первую очередь использовать для лечения тяжелых заболеваний. Но и в этом случае существуют важные вопросы безопасности и эффективности, на которые надо ответить. И даже если мы согласимся не редактировать зародышевые линии и не заниматься улучшениями и договоримся о критериях безопасности, некоторые все равно продолжат сомневаться, имеем ли мы право изменять то, что уготовано нам самой природой.

Важно отметить, что лечение с использованием CRISPR – новейшее веяние в уже устоявшейся области генной терапии. По состоянию на январь 2023 г. в США было одобрено пять препаратов генной терапии[323], и ни один из них не использует CRISPR. Во всех случаях вводят работающую копию гена, чтобы компенсировать поломку в мутантном гене, но при этом невозможно проконтролировать, где в человеческом геноме окажется введенный ген. Например, при гемофилии В – редком нарушении свертываемости крови, вызванном низким содержанием участвующего в свертывании белка, – с помощью вируса вводят здоровые копии гена, кодирующего фактор свертывания. Эффективность такого вмешательства показана в клинических исследованиях. Компания CSL Behring, разработавшая этот препарат, запрашивает 3,5 млн долларов за однократное введение, установив тем самым новый рекорд самого дорогого лекарства в мире. Будем надеяться, что за счет повышенной эффективности и специфичности CRISPR-системы с направляющей РНК будущие препараты генной терапии станут безопаснее и дешевле.

Осознавая как возможность спасения жизней, так и существование подводных камней в генной инженерии, ведущие специалисты США в области биомедицины, права и биоэтики собрались 24 января 2015 г. в калифорнийском городе Напа, чтобы открыто обсудить наиболее взвешенные подходы к развитию направления. Эти авторитетные эксперты пришли к консенсусу, решительно запретив редактирование генов в зародышевой линии в ближайшем будущем, но допустили, что в дальнейшем будет разработано руководство для ответственного использования таких практик. Специалисты также подчеркнули важность поддержки исследований, обеспечивающих открытость их проведения, для оценки эффективности и специфичности применения технологий CRISPR на людях и не только и выступили за организацию публичных обсуждений в целях информирования общественности о рисках и преимуществах CRISPR[324]. Главной задачей собравшихся, которую разделяют и многие другие представители научного сообщества, было не допустить потери общественного доверия к технологии CRISPR. Такая утрата доверия возможна, если страх и неопределенность насчет возможных рисков окажутся сильнее преимуществ, которые можно получить при ответственном и регулируемом использовании новейшего инструмента.

Использование CRISPR для лечения людей не единственная область применения этой технологии, где большие возможности встречаются с большими проблемами. Также неоднозначно применение CRISPR с целью возможного изменения окружающей среды. Один план, вызвавший особенно сильное воодушевление и одновременно озабоченность, касается очень неприятного комара.

Малярия – огромная проблема здравоохранения; от нее ежегодно умирает более полумиллиона детей, преимущественно в Африке и Юго-Восточной Азии. Мы знаем причину происходящего: виноват микроскопический паразит под названием плазмодий, которому для поддержания жизненного цикла необходим определенный вид комаров, а именно малярийный. Плазмодий попадает в малярийного комара, когда тот кусает зараженного человека. Затем плазмодий размножается внутри комара. В следующий раз, когда комар кусает человека, плазмодий передается с укусом и продолжает свой инфекционный цикл.

В борьбе с малярией используют различные методы здравоохранения. Малярийные комары активны ночью, после того как люди ложатся спать, поэтому москитные сетки над кроватями обеспечивают существенную защиту. Осушение болот и других открытых водоемов помогает снизить численность комаров. Но был предложен и гораздо более радикальный подход: искоренить малярийных комаров как вид. В принципе, это возможно сделать с помощью нашей РНК-направляемой CRISPR-системы[325].

Метод называется «генный драйв CRISPR». Он заключается в создании комбинации Cas9 и единой направляющей РНК, которая метит в ген комара, необходимый для фертильности (способности к размножению) самки. Этот ген есть и у самцов, и у самок, но работает он только у самок. Идентифицировать такие гены оказалось несложно: комары состоят с дрозофилами в некотором родстве, а у дрозофил в ходе многолетних исследований были выявлены гены, необходимые для фертильности самок, сходные с такими же по функции генами комаров. Когда малярийному комару вводят фрагмент ДНК, кодирующий белок Cas9 и единую направляющую РНК, нацеленную на ген, связанный с фертильностью, система CRISPR собирается внутри комара и разрезает ген фертильности. Пока все довольно просто, но теперь скажу про нечто действительно необычное. Так вот, вводимая ДНК сделана таким образом, что она используется в качестве донорной матрицы для гомологичной рекомбинации, и в результате последовательности, кодирующие Cas9 и единую направляющую РНК, вставляются в ген фертильности комара. Таким образом, одна и та же вставка выполняет сразу две задачи: выключает ген фертильности у самок и встраивает механизм, необходимый для передачи этого генетического выключателя потомкам.

В итоге все самки, родившиеся от комара-самца, несущего такой генный драйв, становятся бесплодными, а самцы остаются способными к размножению и передают дальше по наследству эту CRISPR-систему, встроенную в их ДНК. CRISPR распространяется по всей популяции до тех пор, пока доля бесплодных самок не возрастет настолько, что популяция вымрет.

Исследований генного драйва CRISPR достаточно, чтобы уверенно утверждать, что он действительно работает в природе. Конечно, учитывая огромное преимущество, которым будет обладать комар, устойчивый к технологии CRISPR, вероятно, появятся комары-мутанты с таким признаком. Тем не менее, если несущих CRISPR комаров выпустить в природу, они скорее всего уничтожили бы популяцию малярийных комаров, и потенциально это предотвратило бы ужасную смерть от малярии для сотен тысяч детей ежегодно.

Преимущества подобного вмешательства очевидны. А как насчет рисков? Они менее понятны. Рассмотрим вопрос, который недавно обсуждался в авторитетном издании Proceedings of the National Academy of Sciences USA: «Генный драйв на основе CRISPR – идеальное решение для биоконтроля или глобальная угроза для природы?»[326] Возможные экологические последствия от выпуска в естественную среду системы с генным драйвом оценить непросто. На первый взгляд кажется, что стрекозы, птицы, летучие мыши и пауки, питающиеся взрослыми комарами, или рыбы, питающиеся личинками комаров, могут пострадать, если популяция малярийных комаров будет уничтожена. Но экологи, изучавшие роль малярийных комаров в цепи питания, считают такое развитие событий маловероятным, поскольку все эти хищники охотно поедают также комаров других видов и иных насекомых[327].

Передаваясь от комара к комару, CRISPR-система в редких случаях может промахиваться, минуя ген-мишень и вставляясь в итоге куда-то еще в геноме комара. И последствия такого случая предсказать очень сложно. Скорее всего, потомство уже не будет бесплодным, а истребление комаров окажется менее эффективным. Существует даже вероятность, что такая ошибка каким-то образом поможет распространению гена, повышающего приспособленность комара, и это еще сильнее усугубит ужасную проблему.

Подобные катастрофичные сценарии можно было бы игнорировать, как почти нереальные, если бы не предыдущий печальный опыт человечества по внедрению чужеродных видов в окружающую среду. В 1935 г. один ученый, работавший в рамках правительственной программы, размножил и выпустил в Австралии жабу-агу для борьбы с жуком, поедающим сахарный тростник, и первоначальные 102 выпущенные жабы расплодились, образовав популяцию, превышающую миллиард особей. Эти огромные жабы ядовиты, и любое местное животное, которое их съест, скорее всего, погибнет. Еще пример: производители тростникового сахара завезли на Гавайи для борьбы с крысами яванского мангуста, но вместо крыс мангуст нашел более доступную пищу – птенцов и черепашьи яйца. Аналогичным образом в Новой Зеландии выпустили горностаев из Англии для борьбы с другим завезенным видом – кроликом, но горностаи начали уничтожать местных птиц, в том числе символ Новой Зеландии – киви. В 1930-х и 1940-х гг. Служба охраны земельного фонда США доплачивала фермерам за выращивание пуэрарии[328] – растения родом из Японии, которое сажали для предотвращения эрозии почв и создания декоративных изгородей, но она разрослась столь стремительно, что буквально похоронила под собой некоторые леса в южных штатах.

Эти и многие другие случаи, когда внесение чужеродных видов в новую среду повлекло непредвиденные последствия, вынуждают нас задуматься, прежде чем выпускать генетически модифицированных комаров с генным драйвом CRISPR в пораженные малярией районы Африки. Более того, даже если генный драйв сработает против комаров, как и предполагалось, неизбежно возникнет желание распространить эту технологию для уничтожения таких инвазивных видов, как пуэрария, черные крысы, моллюск речная дрейссена и улитка гигантская ахатина. Каждый из этих проектов привлекателен, но содержит свой набор возможных подводных камней, которые надо тщательно рассмотреть.

Это ставит нас в трудную ситуацию. Уничтожение малярийных комаров практически уничтожило бы малярию, предотвратило бы миллионы случаев заболевания и полмиллиона смертей в год, в основном среди детей. Поэтому генный драйв CRISPR выглядит чрезвычайно привлекательным. Кажется, что окружающая среда прекрасно обойдется без малярийного комара, поскольку существует множество комаров других видов, которые продолжат процветать. Но, но, но… Не зная наверняка, не следует нажимать на курок. Поэтому в 2016 г. Национальные академии наук, инженерии и медицины США после года изучения этой проблемы пришли к выводу, что, прежде чем внедрять генный драйв CRISPR, необходимы дополнительные исследования[329].

Пока судьи еще не определились насчет генного драйва CRISPR, стоит подумать, как помочь планете, применяя эту технологию редактирования генов не так инвазивно[330]. Совершенно очевидно, что климат на Земле меняется. В период 2014–2023 гг. мы пережили восемь самых жарких лет за всю историю наблюдений[331]. Из-за длительной засухи на западе США уровень воды в крупнейших водохранилищах страны Мид и Пауэлл упал до исторического минимума. Повышение температуры океана приводит к обесцвечиванию коралловых рифов, потому что кораллы теряют водоросли, служащие пищей для них и других морских обитателей. Здоровые коралловые рифы не только красивы, но и важны для всей экосистемы, поскольку здесь живет до четверти всех морских обитателей.

Какое отношение к этому имеет редактирование генов с помощью CRISPR? Изменяя гены или вставляя новые в геном, можно помочь организму выживать и процветать в более жарком и засушливом мире. Конечно, при наличии достаточного запаса времени благодаря дарвиновской эволюции коралловые рифы, сельскохозяйственные растения и многие другие виды из зоны риска, вероятно, смогут адаптироваться к изменениям климата без дополнительной помощи. Но изменение климата происходит так быстро, что случайные мутации и естественный отбор за ним не успевают. Может понадобиться помощь, чтобы спасти эти организмы от вымирания. Поэтому ученые используют CRISPR, чтобы повысить у культурных растений устойчивость к жаре и засухе. Конечно, агрохимические компании корректировали гены растений и до открытия CRISPR, но скорость, эффективность и специфичность правки с помощью CRISPR с направляющей РНК быстро сделали эту технологию очень популярной. Ученые даже пытаются модифицировать морские кораллы так, чтобы они могли жить в более теплой воде и не обесцвечиваться. Здесь CRISPR имеет еще более выраженные преимущества. Не существует отдельной области «генетика кораллов», нет технологий, которые раньше использовались бы для этих целей, поэтому то, что редактирование CRISPR работает на кораллах, как и на всех других организмах, на которых его пробовали, означает, что сейчас это единственный доступный инструмент для изменения генома у кораллов[332].

Существует еще один способ использовать CRISPR для решения проблем климатического кризиса – производить более совершенное биотопливо. Когда мы обогреваем наши дома, ездим на автомобилях и вырабатываем электричество, чтобы заряжать наши мобильные телефоны, мы все еще в основном используем ископаемое топливо. В 2022 г. в США около 80% всей потребляемой энергии было получено при сжигании нефти, угля и природного газа и только 20% – от солнечных, ветряных и атомных электростанций[333]. При сжигании ископаемого топлива образуется углекислый газ, создающий сильный парниковый эффект, из-за которого наша планета нагревается. Но если бы мы использовали растения или водоросли для производства биотоплива, система была бы ближе к равновесию: пока растения живут, они в процессе фотосинтеза поглощают углекислый газ из атмосферы, а это компенсирует выделение углекислого газа при сжигании полученного из них топлива. Сначала эти расчеты вызвали энтузиазм, и правительство поддержало проекты переработки кукурузы в этанол, который смешивали с бензином для образования более «зеленого» топлива. Но у этого варианта есть свои проблемы, среди которых – сокращение производства кукурузы как продукта питания, а также то, что энергия, необходимая для выращивания и переработки кукурузы, в значительной степени сводит на нет преимущества, полученные от фиксации углерода[334]. Водоросли на той же единице площади производят в 20 раз больше топлива, чем кукуруза, могут выращиваться на землях, непригодных для сельского хозяйства, и использовать соленую воду, а не пресную, необходимую для полива кукурузы[335]. И здесь редактирование генов с помощью CRISPR имеет большое значение. У водорослей нет эволюционной предрасположенности быть суперпроизводителями этанола, но их геном можно перепрограммировать так, чтобы значительно увеличить синтез этого биотоплива[336].

Метан – газ, который используется в газовых котлах и газовых плитах, – значительно усиливает глобальное потепление, если попадает в атмосферу, а не сжигается. Упоминание одного из основных источников выбросов метана всегда вызывает улыбку: это отрыжка и пуканье у коров. Удивительно, но 40% ежегодных выбросов метана выделяется скотом, а точнее бактериями в его пищеварительной системе. Вполне вероятно, что, отредактировав гены с помощью CRISPR, можно переключить эти бактерии с выделения метана на фиксацию углерода в виде более безопасных молекул, например сахара или жира[337].

Еще один способ уменьшить количество парниковых газов в атмосфере – ускорить то, чем растения все время занимаются, а именно превращение углекислого газа в сахар и кислород в процессе фотосинтеза. Институт инновационной геномики Дженнифер Даудны[338] запустил масштабную программу по усилению присущей растениям и почвенным бактериям способности поглощать углекислый газ из воздуха и накапливать углерод. Ученые используют генетическое редактирование с помощью CRISPR, чтобы повысить у растения интенсивность фотосинтеза и увеличить возможность корневой системы накапливать углерод[339]. С помощью этого подхода можно, вместо того чтобы просто устранять последствия изменения климата, фактически обратить вспять сам ход климатической трансформации. Удастся ли CRISPR с направляющей его РНК спасти планету? Время покажет.

С глубоким изумлением исследователи обнаружили, что у бактерий миллиарды лет существовала система CRISPR. Теперь, когда она открыта, ученые могут перестроить ее так, чтобы вырезать или изменять определенные участки ДНК в геноме человека, и это вызывает не меньшее изумление. Но если взглянуть на те же факты под другим углом, мы увидим, что РНК выполняет старые трюки. При любом способе применения CRISPR направляющая РНК использует комплементарность, чтобы доставить редактирующий механизм в определенное место сложно устроенного генома. Затем связанный с ней белок – а им может быть каталитически активный Cas9, мертвый Cas9 или другой представитель этой компании – совершает какие-то действия с определенной ДНК-последовательностью.

Ранее мы уже сталкивались с этим механизмом, говоря про РНК-интерференцию и про теломеразу: РНК определяет место, а когда оно найдено, белковый фермент катализирует какую-либо реакцию. Отчасти редактирование генов с помощью CRISPR получило такое стремительное развитие, потому что эта система соответствовала схеме, уже описанной ранее в процессе исследования РНК. Ученые получили принципиально новые ножницы, но при этом уже знали, как с ними работать.